Автореферат: Кариопатические и патоморфологические изменения под действием продуктов метаболизма паразитов и влияние на репродуктивную функцию домашних плотоядных

Примечание:% - от общего количества клеток;, % - от количества делящихся клеток., Р ? 0,01

Таблица 5. Частота кариопатических последствий в семенниках мышей после введения антигена-экстракта личинок анизакид в сравнении с контролем

Примечание:% - от общего количества клеток;, % - от количества делящихся клеток., Р ? 0,01

Максимальное количество митозов отмечали через 48 часов после введения подопытным животным соматического экстракта из личинок анизакид, митотический индекс составил 1,71 (контроль - 0,12). К 72 часам этот показатель снижался. Уже через 4 часа после начала эксперимента отмечали появление патологических митозов. Начиная с 4 и до 48 часов, около 30% делящихся клеток находились в состоянии многополюсного митоза. Известно, что многополюсные митозы возникают довольно легко под воздействием самых разных химических и физических факторов, особенно характерно их появление в опухолевых клетках (Алов И.А., 1972).

Наиболее часто наблюдали такую патологию митоза как образование хромосомных мостов и отставание фрагментов хромосом в анафазе, неравнополюсные анафазы, анэуплоидию. Особенностью кариопатического действия биопрепарата личинок анизакид является образование гигантских многоядерных клеток в красном костном мозге (многоядерных мегакариоцитов).

Также мы определяли соотношение фаз митоза в разных группах. В контрольной группе мышей митотические клетки находились в состоянии анафазы. Через 4 часа после внутрибрюшинного введения антигена анафазы составили 75,0% от общего числа митозов, и 25,0% клеток находились в профазе. Через 12 часов это соотношение не менялось, однако появились первые признаки К-митоза.

В семенниках животных после введения соматического экстракта из личинок анизакид увеличение делящихся клеток также отмечали, начиная с 4 часов, при этом количество патологий находилось на уровне 2%. Через 12 часов произошло значительное увеличение количества профаз, что свидетельствует об увеличении мейотического индекса клеток. К наиболее распространенным патологиям деления относились преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсные анафазы, а также 3-х и 4-х-полюсные анафазы.

Результаты эксперимента по определению протективного действия витаминов А и Е показали, что митотический индекс в костном мозге мышей не превышал 0,5% в течение всего периода наблюдений, но оказался выше контрольных показателей. Количество патологических митозов оказалось несколько ниже, отставания хромосом в анафазе не наблюдали. Показатели числа многополюсных и неравнополюсных митозов в период с 24 до 48 часов были снижены по сравнению с аналогичными данными, полученными в предыдущем опыте, однако через 72 часа было отмечено повышение уровней обоих процессов. Соотношение профаза-анафаза во время всего периода наблюдений смещалось в сторону последних (83,3%). Количество многоядерных клеток не отличалось от данного показателя у животных, не получавших витамины.

При введении подопытным мышам антигена анизакид, подвергнутого кипячению и СВЧ-обработке, количество патологических фигур митоза увеличивалось в 2,5 раза по сравнению с контролем, а число многоядерных клеток - в 10 раз соответственно. Количество патологий митоза при термической обработке антигена снижалось в первом случае до уровней контрольной группы, тогда как при СВЧ-обработке оно превышало этот уровень в 2,5 раза.

При микроскопии мазков-отпечатков, сделанных с семенников опытных и контрольных животных, отмечали активное деление клеток, патологические мейозы, как на стадии метафазы, так и на стадии анафазы. При этом количество делящихся клеток во всех группах животных находилось на уровне контроля, в то время как патологии мейоза встречались в первой группе подопытных животных, которым вводили антиген после заморозки, в 20 раз чаще через 24 часа после введения и в 59 раз - через 48 часов. Обработка кипячением и микроволнами снижала кариопатическое действие антигена, однако частота патологий деления клеток превышала контрольный уровень почти в 10 раз. Нарушение фигур деления клеток наиболее часто выражалось преждевременным расхождением отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсными анафазами с образованием хромосомных мостов, а также трех- и четырех-полюсными анафазами. Подобные патологии деления приводят к формированию анэуплоидных дочерних клеток, многоядерности, а также появлению ядрышек.

Количество многоядерных клеток под воздействием антигена-экстракта увеличивалось незначительно - в 1,5 раза, а при высокотемпературной обработке антигена оно не превышало показателей контроля. Появлялись гигантские клетки с количеством ядер от 2 до 9, каждое из которых, в свою очередь, находилось в состоянии деления.

Пероральное введение нематод приводило к резкому увеличению количества делящихся клеток в красном костном мозге. При этом значительное количество митозов было многополюсным.

В семенниках показатель деления сперматоцитов незначительно повышался. Среди патологических фигур деления наиболее часто отмечали преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, а также наличие многоядерных клеток. Количество патологий деления в третьей группе превысило контрольный показатель более чем в девять раз.

При исследовании морфологии клеток периферической крови экспериментальных крыс в группе животных, ежедневная доза кормления которых составила 100 личинок, были выявлены кариопатические нарушения. Около 1,5-2,5% лейкоцитов имели патологии ядра, проявляющиеся в формировании «ракеток» (лишняя Х-хромосома), бобовидные или лопастные ядра лимфоцитов, лимфоциты с эозинофильной зернистостью цитоплазмы.

При скармливании крысам мышечной ткани инвазированной рыбы также происходили кариопатические изменения. В красном костном мозге количество митозов превысило показатели контроля в 4 раза, а в 3 группе животных (более 50 личинок) - в 5 раз. Патологии деления отмечали во всех опытных группах. Как и при внутрибрюшинном введении антигена анизакид, при пероральном введении как самих личинок, так и инвазированной рыбы в красном костном мозге грызунов выявляли гигантские многоядерные клетки.

В семенниках сперматогенез был несколько снижен, при этом статистически значимое увеличение количества патологий выявлено в 3 группе, которая выражалась в появлении К-митоза и преждевременном расхождении отдельных хромосом в метафазе. Чем интенсивнее была инвазирована рыба, тем сильнее проявлялись кариопатические изменения сперматоцитов, частота которых в четыре раза превысила контрольный уровень в группе животных, получавших рыбу, содержащую более 50 личинок анизакид.

Полученные при проведении предыдущих экспериментов результаты привели к необходимости выяснить, является ли инвазированная анизакидами рыба после проведения кулинарной обработки мутагеном для клеток красного костного мозга и сперматоцитов лабораторных животных. С этой целью проводили скармливание крысам рыбы, обработанной варкой и СВЧ-лучами.

Проведенное исследование клеток красного костного мозга показало увеличение активности деления в обоих случаях, особенно при использовании вареной рыбы. В этой же группе животных было выявлено значительное увеличение количества патологий деления, которые, в основном, проявлялись в виде многополюсного митоза, реже отмечали отставание отдельных хромосом в анафазе, неравнополюсные анафазы с мостом, К-митоз и формирование ядрышек. Также в обеих группах лабораторных животных отмечалось увеличение количества многоядерных мегакариоцитов.

При скармливании рыбы, подвергнутой термической обработке, в семенниках крыс отмечали некоторое усиление сперматогенеза, которое происходило, в основном, за счет ана- и телофаз. При этом рыба, обработанная в микроволновой печи, практически не оказывала антимитотического действия, тогда как вареная вызывала увеличение количества патологий деления клеток почти в пять раз. В то же время оба продукта стимулировали формирование многоядерных клеток, количество которых превзошло контрольный уровень в три раза.

б) соматический экстракт из Toxocara canis

При внутрибрюшинном введении соматических продуктов T.canis костный мозг реагировал значительным увеличением митотического индкеса, которое отмечалось через 4 и 72 часа, тогда как к 12 часам количество делящихся клеток резко снизилось. В остальные периоды наблюдений митотический индекс не отличался от контрольных показателей. Следовательно, действие антигенов данного гельминта было незначительным и сопровождалось патологией деления небольшого количества клеток в виде многополюсных митозов и отставания отдельных хромосом в анафазе.

Изменения сперматогенеза проявились более выражено резким увеличением количества патологических фигур деления, которые даже спустя 72 часа превысили контрольный уровень в три раза. Среди патологических фигур были отмечены преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе, неравнополюсные анафазы, а также трех- и четырех - полюсные анафазы, которые, однако, не привели к увеличению количества многоядерных клеток, оставшись незавершенными. Незавершенный процесс деления привел к снижению количества делящихся клеток в целом, которое проявилось через 48 часов и оставалось ниже контрольного уровня до конца эксперимента. Следовательно, соматический экстракт из токсокар оказывает более выраженное патогенное действие на сперматоциты, чем на клетки красного костного мозга.

г) метаболиты личинок Toxocara canis

Костный мозг начинал реагировать на внутрибрюшинное введение метаболитов токсокары уже через четыре часа, при этом митотическая активность повысилась в два раза по сравнению с контролем. К 12 часам активность деления клеток упала ниже показателей контрольной группы, однако через сутки она резко повысилась (в 3 раза по сравнению с контролем), а затем постепенно стала снижаться. Патологические фигуры митоза были выявлены через 4 и 24 часа, при этом их количество достигало 10% от общего числа делящихся клеток.

В семенниках активизацию деления клеток выявляли, начиная с 12 часов и до конца периода эксперимента, при этом мейотическая активность повышалась незначительно (не более 2%). В то же время патологии деления клеток отмечали на протяжении всего периода наблюдений. Количество неправильных фигур деления начинало возрастать через 4 часа после введения экскреторно-секреторных антигенов, достигало максимального показателя (в четыре раза выше по сравнению с контролем) через сутки, а к третьим суткам - приближалось к контрольному уровню.

Наиболее часто среди нарушений деления клеток, как красного костного мозга, так и семенников, отмечали многогрупповые анафазы, при которых расхождение хромосом происходит к трем и более полюсам, а также преждевременное расхождение отдельных хромосом в метафазе. Выявленные патологии приводят к неравномерному распределению хромосом в дочерних клетках, анэуплоидии или многоядерности.

В ходе нашего эксперимента было установлено, что воздействие продуктов гельминта на костный мозг лабораторных животных происходит в два этапа. Первый этап характеризуется повышением митотической активности и количества патологий деления уже в первые 4 часа после однократного внутрибрюшинного введения биоматериала. Повреждение митотического аппарата под действием токсокар происходит на уровне клеточных центров, количество которых может увеличиваться, в результате чего митоз приобретает многополюсный характер, а также на состоянии кинетохорных микротрубочек, что проявляется в виде отставания отдельных хромосом в анафазе. Происходящие изменения приводят к снижению общего количества делящихся клеток, которое отмечается уже спустя 12 часов.

Полученные нами белковые экстракты и метаболиты являются по своему составу сложными системами, отдельные компоненты которых при введении лабораторным мышам всасываются с разной скоростью. При этом экскреторно-секреторные продукты, по-видимому, вступают во взаимодействие с ядерными структурами несколько быстрее, нежели соматические, вызывая изменения в клетках в более ранние сроки. Под воздействием метаболитов наблюдается интенсивная стимуляция деления клеток красного костного мозга без возникновения патологий, что свидетельствует о развитии адекватного иммунного ответа у экспериментальных животных.