2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы
Исследования паразитофауны домашних плотоядных
Для определения экстенсивности инвазии кишечными паразитами проводили обследование домашних кошек и собак, которые поступали в ветеринарные клиники города. Кроме того, обследованию подвергали собак различных служебных пород (немецкая, кавказская, среднеазиатская и французская овчарки, ротвейлеры, лабрадоры, сенбернары, русские спаниели, американские кокер-спаниели и спрингер-спаниели) в возрасте от 1 месяца до 9 лет, принадлежавших питомнику Зонального кинологического центра при ГУВД г. Перми, колониям общего режима и питомнику при Пермском колледже юстиции. Для выявления инвазированности безнадзорных животных обследовали кошек и собак из Пермского муниципального приюта.
Фекалии плотоядных собирали сразу после выделения в чистую сухую пластиковую промаркированную посуду. Исследование проводили комбинированным методом Г.А. Котельникова и В.М. Хренова (1984 г.) с раствором аммиачной селитры плотностью 1,3 г/мл. Для диагностики криптоспоридиоза готовили тонкие мазки фекалий с последующим окрашиванием по методике Циля - Нильсена. Для выявления цист лямблий и других простейших, а также яиц трематод свежевыделенные фекалии собирали в контейнеры с консервантом Турдыева, тщательно перемешивали и исследовали методом формалин-эфирного осаждения (Новикова Т.В., 2005). Исследования на лямблиоз проводили трехкратно с интервалом 3-5 дней (Бандурина Т.Ю., Кнорринг Г.Ю., 2003; Коровина Н.А., 2004).
Для диагностики дирофиляриоза собирали пробы венозной крови в количестве 2-3-мл с добавлением гепарина; 1 мл гепаринизированной крови отстаивали с 9 мл дистиллированной воды в течение 5 мин, затем центрифугировали 5 мин при 2000 об/мин и исследовали осадок на наличие личинок - микрофилярий (Ястреб В.Б., 2005).
Посмертно проводили компрессорную трихинеллоскопию поперечно-полосатых мышц для выявления инцистированных личинок. Таким образом, было исследовано 113 трупов собак и 143 - кошек как домашних, так и безнадзорных.
Для диагностики кровепаразитарных заболеваний (пироплазмоз) готовили тонкие мазки периферической крови собак, полученной из когтя, окрашивали их по методике Романовского-Гимзы, а затем микроскопировали под иммерсионным увеличением микроскопа. Всего таким способом было анализировано 180 проб.
Для обнаружения антител к возбудителю токсоплазмоза собирали сыворотку крови домашних и содержащихся в приюте собак и кошек и исследовали с помощью иммуноферментной тест - системы «ИФА - анти-Тох. g - Cate - Dog» (Казанская ГАВМ), предоставленной профессором Р.Х. Равиловым. Таким образом, было обследовано 218 животных.
Обнаружение антител к антигенам лямблий проводили у собак с помощью диагностического набора (Вектор-Бест). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови собаки, меченные пероксидазой хрена (Медгамал) в титре 1:4000.
Гистологические исследования.
От абортировавших или оперированных по поводу овариогистеректомии кошек и собак собирали плоды, плаценты, матку и яичники. От экспериментальных белых мышей и лабораторных крыс собирали печень, селезенку, костный мозг, участки тонкого кишечника, семенники, матки, яичники, плаценты. Собранный материал промывали, фиксировали 10%-ным раствором нейтрального формалина с целью уплотнения. Далее производили вырезку кусочков и проводку их по спиртам возрастающей крепости с целью обезвоживания по общепринятой методике. После проводки кусочки заливали в парафин и изготавливали блоки 2х2 см. С полученных блоков на микротоме-полуавтомате делали срезы толщиной 4-5 микрон. Их помещали на предметное стекло и окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная методика) и по ван Гизон с целью выявления степени развития склеропластических процессов в органах. Просмотр готовых препаратов производили с помощью микроскопа фирмы «Leica» и «Zeiss» при увеличении окуляра х10, с объективами х4; х40 и х100 с подробным описанием имеющейся морфологической картины в органах. Оценивали дисциркуляторные, дистрофические, склеропластические, воспалительные, гиперпластические, регенераторные процессы в органах.
В семенниках описывали состояние сперматогенного эпителия, наличие митозов и степень выраженности сперматогенеза. В плаценте животных оценивали четыре группы основных процессов: инволютивные, компенсаторные, дисциркуляторные и воспалительные. В костном мозге - степень развития каждого ростка гемопоэза с выявлением возможных нарушений морфогенеза клеток. В органах РЭС (печень, селезенка) производили оценку морфологии и локализации клеток макрофагально-гистиоцитарного ряда с целью выяснения их структурно-функциональной принадлежности (воспалительный или иммунокомпетентный генез). Для этого использовали иммуногистохимический метод с антителами S-100 и CD99. Иллюстративный раздел работы выполнен с использованием цифровой видеокамеры «Sony» на компьютере «Pentium-III» и Toshiba. Наиболее интересные и показательные фрагменты микропрепаратов фотографировали и сохраняли в памяти компьютера.
Получение материала из гельминтов, приготовление соматического экстракта и его биохимический анализ
Для паразитологического исследования использовали свежемороженую рыбу, приобретенную в различных торговых точках города. После размораживания тушки рыбы вскрывали по общепринятой методике. Обнаруженных гельминтов извлекали, подсчитывали их количество (интенсивность - ИИ и экстенсивность инвазии - ЭИ). Выделенных личинок нематод фиксировали в жидкости Барбагалло для последующего определения и описания. Определение принадлежности выделенных личинок проводили с применением ключа, основанного на морфологических особенностях этих паразитов (Гаевская А.В., 2005). Часть гельминтов фиксировали в 10%-ном формалине и проводили гистологическое исследование по описанной выше методике. Жизнеспособность анизакисов устанавливали с помощью температурного теста в растворе искусственного желудочного сока.
Извлеченных из тушек рыбы личинок A.simplex 3-й стадии тщательно многократно промывали проточной водой, затем обрабатывали растворами антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и нистатин), стерильным физиологическим раствором и замораживали. После многократного замораживания и оттаивания личинок гомогенизировали, заливали стерильным забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и экстрагировали при температуре +4°С в течение 18 часов. После этого раствор сливали и процедуру повторяли. Полученный антиген хранили в замороженном состоянии при температуре -10°С.
Контроль на стерильность. Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу экстракта из личинок анизакид высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке. Для выявления грибковой контаминации антиген высевали на агар Сабуро в две чашки Петри. На микоплазменную контаминацию пробу антигена высевали на универсальной плотной среде для выделения микоплазм (ООО «Научно-производственная фирма Диагност-Мед») согласно инструкции в две чашки Петри. Посевы на МПА, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при +37°С, посевы на полужидком агаре - 14 дней при +37°С, и на среде Сабуро - 15 дней при +23°С. При обнаружении хотя бы одного из контаминантов партию экстракта считали нестерильной и в дальнейшей работе не использовали.
Определение содержания белка. Концентрацию белка в полученном экстракте определяли на биохимическом полуавтоматическом анализаторе StatFax 1904+ (AWARENESS technology inc) с использованием набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции, при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали фосфатно-солевой буферный раствор.
Для сравнения кариопатического и антигенного действия белкового экстракта из личинок анизакид с антигенами других гельминтов готовили соматические экстракты из Diphyllobothrium latum, Hydatigera taeniamorfis, Toxocara canis. Проводили их биохимический анализ на биохимическом анализаторе StatFax 1904+ с помощью набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции: аспартат-аминотрансфереза, аланин-аминотрансфераза, щелочная фосфатаза, триглицериды.
Получение экскреторно-секреторного антигена T. canis
В качестве антигена также использовали метаболиты, полученные при культивировании яиц и личинок T.canis. Для этого выделенных от спонтанно зараженных животных гельминтов обрабатывали по описанной выше методике. Самок нематод вскрывали, извлекали матку с яйцами, которые культивировали в жидкой питательной среде 199 с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Perbio) при температуре +37°С в течение 7 дней. Метаболиты личинок собирали, очищали центрифугированием и замораживали при температуре -10°С для дальнейшего использования. Контроль на стерильность и определение содержания белка проводили с помощью методов, описанных ранее.
Изучение кариопатических свойств антигенов гельминтов
Для изучения кариопатического действия антигенов гельминтов проводили однократное внутрибрюшинное введение нелинейным белым мышам-самцам массой 18-20 г. 100 мкг белка-антигена. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1 мл забуференного физиологического раствора. Количество животных в каждой группе составило 12. Убой мышей проводили через 4; 12; 24; 48 и 72 часа после введения материала.
Для выявления протективного действия на клетки красного костного мозга витаминов-антиоксидантов группе мышей в течение пяти дней перорально вводили масляный раствор «Аевит» в терапевтической дозе, затем также проводили внутрибрюшинное введение белкового экстракта в дозе 100 мкг.
Для определения эффективности термической обработки пробу антигена-экстракта A.simplex обрабатывали с помощью СВЧ-нагревания в бытовой микроволновой печи в течение 1 мин. Также применяли обработку белкового экстракта 15-минутным кипячением на водяной бане. Обработанные таким образом антигенные продукты использовали для введения мышам-самцам по описанной выше схеме. После этого по стандартной методике проводили гистологическое исследование печени, селезенки, красного костного мозга и семенников. Также из красного костного мозга грудины и семенников готовили мазки-отпечатки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду, а затем окрашивали азур-эозином по Романовскому. При микроскопировании подсчитывали количество делящихся клеток, учитывали форму, размеры и окраску ядер. Отмечали количество цитопатических и кариопатических нарушений в опытных и контрольных группах животных.
Оплодотворяющая способность мышей-самцов после внутрибрюшинного введения соматического антигена из личинок анизакид
Для выявления действия антигена-экстракта из личинок анизакид на функцию размножения проводили внутрибрюшинное введение самцам мышей массой 22-24 г. данного антигена как описано выше. К каждому самцу подсаживали по 4 взрослых интактных самки и оставляли на 3-4 дня. Контролем служили самки того же возраста, подсаженные к интактным самцам. С этого дня начинали отсчет сроков беременности. Кормление и содержание опытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента. Затем самцов отсаживали, а самок содержали до 20 дня беременности, после чего подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Извлекали матку с яичниками. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество плацент и плодов. Выявляли предимплантационную и постимплантационную смертность плодов. Штангенциркулем определяли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств (отсутствие глаз, пальцев, расщепление неба и т.д.).
Морфологические изменения плаценты белых крыс при пероральном введении личинок анизакид, контроль эмбрионального развития
Для определения влияния экскреторно-секреторных и соматических продуктов личинок Anisakidae на эмбриональное развитие плодов использовали половозрелых нелинейных лабораторных крыс-самок (Rattus norvegicus) массой 120-150 г. Отобранных беременных животных распределяли на несколько групп. Животным первой, второй и третьей групп перорально вводили личинок анизакид в растворе антибиотиков в дозе соответственно 10, 50 и 100 экз. на животное. Сроки введения составляли 1-2 день, 7-8 день и 13-14 дни беременности, которые являются критическими сроками эмбриогенеза крыс (соответственно образование зиготы, закрытие невропора и активного органогенеза). Животным четвертой группы выпаивали только антибиотики на 0,9%-ном стерильном растворе хлорида натрия в те же сроки. Самки пятой группы служили интактным контролем. Кормление и содержание подопытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента.
Самок подвергали эвтаназии на 20 сутки под воздействием эфира методом декапитации. При вскрытии извлекали матку с плодами и яичники. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке - количество плацент и плодов. Определяли предимплантационную и постимплантационную смертность. С помощью штангенциркуля измеряли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств.