Министерство образования и науки Республики Казахстан
Казахский
национальный университет им. аль-Фараби
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
специальность
5В070100
- «Биотехнология»
Төлегенова
Д.А.
Алматы 2014
Министерство образования и науки Республики Казахстан
Казахский национальный университет им. аль-Фараби
Кафедра
биотехнологии
«Допущен к защите»
___________
Заведующим кафедрой
биотехнологии Заядан Б.К.
ДИПЛОМНАЯ РАБОТА
На тему:
«ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ НА НЕФТЕОКИСЛЯЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ-КАНДИДАТОВ
В АССОЦИАЦИЮ-ДЕСТРУКТОР»
по специальности 5В070100 - «Биотехнология»
Выполнила Төлегенова Д. А..
Научные руководители
к. б. н., доцент
Кайырманова Г. К.
Нормоконтролер
Бектилеуова
Н.К.
Алматы,
2014
РЕФЕРАТ
Дипломная работа состоит из 50 страниц, 8 рисунков, 10 таблиц, 44 источников литературы.
Ключевые слова: нефтешлам, углеводородокисляющие микроорганизмы, влияние температуры.
Цель работы: изучение влияния температурных условий на нефтеокисляющую способность аборигенных углеводородородокисляющих микроорганизмов.
Задачи: выделить культуры нефтеокисляющих микроорганизмов из жидких и твердый проб нефтешлама, а также выявить влияние температур +5° С, +20° С, +60° С на нефтеокисляющую активность.
Методы: метод выделения накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов, метод выделения чистых культур, метод идентификации микроорганизмов, методы изучения роста микроорганизмов при температуре -5° С, +20° С, +60° С, метод количественного определения микроорганизмов.
Результаты: выявлено, что выделены культур нефтеокисляющих микроорганизмов оказались не способны к утилизации нефти при +5° С, +60° С, а при при +20°С - обильный рост наблюдался у культур Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14
Практическое
использование: Изучению
влияния температурных условий на их нефтеокисляющую активность могут быть
использованы в создании биопрепарата на основе ассоциации музейных культур
микроорганизмов с аборигенными культурами для биоремедиации земель с высокой
степенью нефтезагрязнения.
РЕФЕРАТ
Диплом жұмысы 50 беттен, 8 суреттен, 10 кестеден және 44 әдебиет көздерінен тұрады.
Түйін сөздер: мұнай қалдығы, көмірсутек тотықтырушы микроорганизмдер, температура әсері, полигон-жинақтаушы, "Жанажол" кен орны.
Зерттеу жұмысының мақсаты: жергілікті көмірсутек тотықтырушы микроорганизмдердің мұнайды тотықтыру қабілетіне температура әсерін зерттеу.
Жұмыстың міндеттері: сұйық және қатты күйдегі мұнай қалдығы сынамаларынан мұнай тотықтырушы микроорганизмдер дақылдарын бөліп алу, және олардың мұнай тотықтырушы белсенділігіне +5°С, +20°С, +60°С температуралардың әсерін айқындау.
Зерттеу әдістері: мұнай тотықтырушы бактериялардың жинақтық дақылын бөліп алу, микроорганизмдердің таза дақылын алу әдісі, микроорганизмдерді идентификациялау, микроорганизмдердің -5°С, +20°С және +60°С температураларда өсуін бақылау, Кох әдісі бойынша микроорганизмдердің санын анықтау.
Алынған нәтижелер:
) Мұнай қалдығының 6 түрлі сынамасынан, мұнай тотықтырушы микроорганизмдердің 10 түрлі дақылдары бөлініп алынды;
) Бөлініп алынған дақылдар +5° С, +60° С температура кезінде, мұнайдың утилизациясына қабілетсіз болып шықты, +20°С жоғары мұнай тотықтыру белсенділігін көрсеткен Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14дақылдар болды.
Практикалық қолдануы: Мұнайды
тотықтыру белсенділіктеріне температураның әсерін зерттеу жүргізу
арқылы, микроорганизмдердің мұнай тотықтырушы қабілеттіліктерін,
жоғары дәрежеде мұнаймен ластанған жердің
биоремедиациясы үшін, мұнай тотықтырушы микроорганизмдердің
мұражайлы дақылдары мен жергілікті микроорганизм дақылдарының
ассоциациясы негізінде биопрепараттар алу үшін қолдануға
болады.
АBSTRАСT
Diрlоmа wоrk inсludеs 50 раgеs, 8 figurеs, 10 tаblеs, 44 litеrаturе sоurсе.еywоrds: оil-slimе, hydrосаrbоn оxidizing miсrооrgаnisms, influеnсе оf tеmреrаturе, роlygоn- rеsеrvоir, оilfiеld “Zhаnаzhоl”.оаl оf rеsеаrсh: rеsеаrсh thе influеnсе оf tеmреrаturе оn thе оil-оxidizing асtivity оf thе аbоriginаl hydrосаrbоn оxidizing miсrооrgаnisms.
Оbjесtivеs: thе аllосаtiоn thе сulturе оf оil-оxidizing miсrооrgаnisms оf liquid аnd sоlid sаmрlеs frоm оil-slimе аnd rеvеаl thе influеnсе оf tеmреrаturе +5 ° С, +20 ° С, +60 ° С tо thе оxidizing асtivity оf isоlаtеd сulturеs.еthоds: thе аllосаtiоn сumulаtivе сulturеs оil-оxidizing miсrооrgаnisms, thе аllосаtiоn bасtеriоlоgiсаlly рurе сulturеs оf miсrооrgаnisms, thе mеthоd оf idеntifiсаtiоn оf miсrооrgаnisms, mеthоds оf rеsеаrсhing thе grоwth оf miсrооrgаnisms аt thе tеmреrаturе -5 С, +20 С аnd +60 С, quаntifying miсrооrgаnisms by Kосh mеthоds.
Mаin rеsults:
1) frоm 6 sаmрlеs оf оil-slimе аllосаtеd 10 сulturеs оf оil-оxidizing miсrооrgаnisms,
2) сulturеs wеrе nоt сараblе оf utilizing оil аt +5 С аnd +60 С, аnd аt +20 С thе Рs. ssр. ЗГ-2, Рs. ssр. БШС-1 и Рs. аеruginоsа Н14 wеrе сараblе оf utilizing оil.
Аррliсаtiоns: Thе
rеsеаrсh influеnсе оf tеmреrаturе соnditiоns оf оil-оxidizing асtivity саn bе
usеd in thе сrеаtiоn оf а biоlоgiсаl рrоduсt оn thе bаsis оf аssосiаtiоn оf
аbоriginаl сulturеs оf miсrооrgаnisms with thе musеum сulturеs оf оil-оxidizing
miсrооrgаnisms fоr biоrеmеdiаtiоn оf sоils with high оil роllutiоns.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
. Обзор литературы
.1 Влияние нефтезагрязнений на окружающую среду
1.2 Биотехнологические методы очистки нефтезагрязненных экосистем
.3 Влияние температуры окружающей среды на микробную деградацию углеводородов в почве
2. Материалы и методы исследования
.1 Материалы исследования
.2 Методы исследования
2.2.1 Получение накопительных культур нефтеокисляющих микроорганизмов
.2.2 Методы выделения бактериологически чистых культур УОМ и изучения их морфо-культуральных свойств
.2.3 Определение роста микроорганизмов при различных температурах
.2.4 Определение количества микробных клеток высевом на плотные питательные среды (Метод Коха)
3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1 Выделение и изучение аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов
.2 Изучение нефтеокисляющей активности микроорганизмов при различных температурных режимах
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ
ЛИТЕРАТУРЫ
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
УОМ Углеводородокисляющие микроорганизмы
ОМЧ Общее микробное число
КОЕ Колониеобразующа единица
Рs. Рsеudоmоnаsас. Bасillusр. от лат. «subsресiаlеs» - подвиды
нефтезагрязнитель
углеводородокисляющий микроорганизм углеводород
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность. Казахстан - одна из ведущих стран мира по запасам нефти и газа и их добыче. На долю нефтедобывающей промышленности уже сейчас приходится более 40% объемов промышленного производства и экспорта [1]. На сегодняшний день только в Актюбинской области имеются 12 полигонов-накопителей отходов нефтепромышленности, занимающих значительные территории, тем самым снижая площадь хозяйственно-значимых пахотных и пастбищных земель, и являясь вторичным источником загрязнения окружающей среды [2].
Существует большое количество биопрепаратов для биоремедиации нефтезагрязненных почв. Наиболее эффективно выявление активных деструкторов компонентов нефти среди аборигенных микроорганизмов для создания биопрепаратов для нивелирования влияния отходов нефтедобычи полигонов-накопителей. Климатические условия Актюбинской области характеризуются холодной зимой и жарким летом. Температура может колебать от -42° С зимой до +65° С летом. В связи с этим применение биопрепартов с микроорганизмами, не приспособленными к таким климатическим условиям не эффективны в процессе биоремедиации нефтезагрязненных почв.
Цель исследований: изучить влияние различных температур на нефтеокисляющую способность микроорганизмов.
Задачи:
- выделить культуры нефтеокисляющих микроорганизмов из жидких и твердых отходов полигона-накопителя нефтешлама,
- выявить влияние температур +5° С, +20° С, +60° С на нефтеокисляющую активность выделенных культур.
Объекты исследования: коллекционная культура Рsеudоmоnаs аеruginоsа Н14 кафедры биотехнологии Казахского национального университета им. аль-Фараби, аборигенные углеводородокисляющие культуры микроорганизмов, выделенные из нефтешлама полигона- накопителя месторождения «Жанажол».
Работа выполнена в лаборатории
прикладной микробиологии кафедры биотехнологии КазНУ им. аль-Фараби и ДГП
на ПХВ «НИИ Проблем Биологии и Биотехнологии» РГП «КазНУ имени аль-Фараби» в
рамках научно-исследовательского проекта: «Создание новых биопрепаратов для
нивелирования действия нефтедобычи на окружающую среду (на примере
полигона-накопителя месторождения «Жанажол» Актюбинской области)», 2012-2014
гг. - научн.рук. проф. А.А.Жубанова. В работе
использовались традиционные микробиологические методы исследования.
1. Обзор
литературы
.1 Влияние
загрязнения нефти на окружающую среду
Нефть, продукты ее переработки оказывают отрицательное воздействие на воздух, воду и почву.
Экологические проблемы начинаются уже на стадии добычи нефтяного сырья и его поставки на предприятия. Наиболее характерными загрязнителями окружающей среды являются углеводороды (44,9% от суммарного выброса), оксид углерода (47,4%) и различные твердые вещества (4,3%). Не менее острые проблемы возникают при транспортировке нефти на нефтеперерабатывающие предприятия. Нефть транспортируется по трубопроводам, подверженным коррозии, отложениям смол и парафинов внутри труб. В среднем в год происходит более 60 крупных аварий и около 20 тыс. случаев разливов нефти на суше и в водоемах, сопровождающихся гибелью людей и большими материальными потерями [3].
В нефтедобывающие предприятия Казахстана решали проблемы, создаваемые накопленными отходами, строительством шламонакопителей. Однако на сегодняшний день только в Актюбинской области имеются 12 полигонов по размещению отходов производства углеводородного сырья, занимающих значительные территории, и потому не только заметно снижающие площади хозяйственно-значимых пахотных и пастбищных земель, но и являющиеся вторичным источником загрязнения окружающей среды [1].
Нефтешламы (нефтяные шламы) - это сложные физико-химические смеси, которые состоят из нефтепродуктов <#"879741.files/image001.jpg">
Рисунок 1. Схема получения нефтеокисляющей
накопительной культуры
2.2.2 Методы выделения бактериологически чистых культур УОМ и изучения их морфо-культуральных свойств
Выделение чистых культур весьма важно, в связи с этим контроль чистоты культур осуществляется несколькими способами: визуально, микроскопически, высевом на ряд питательных сред. При визуальном контроле просматривается рост микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, культура загрязнена. Такой контроль возможен только для культур, способных расти на поверхности плотных сред [38].
Микроскопическое исследование включает приготовление препарата фиксированных окрашенных клеток и осмотр его с иммерсионной системой или препарат живых клеток и осмотр его, используя фазово-контрастное устройство. Чистая культура многих микроорганизмов, как правило, морфологически однородна; допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток. Чистоту культур микроорганизмов обязательно проверяют высевом на питательные среды. Прежде всего, выделенную культуру высевают на питательную среду, благоприятную для ее роста. Однородность выросших колоний - свидетельство чистоты культуры. Обязателен посев на МПА - среду, которая обеспечивает рост многих хемогетеротрофов. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний или отсутствие роста, если данные микроорганизмы на мясо-пептонном агаре не развиваются.
Метод Дригальского. При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. На поверхность твердой питательной среды, содержащей агар, из пипетки наносят каплю накопительной культуры и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют каплю по поверхности среды в чашке Петри, после чего этим же шпателем протирают поверхность плотной среды последовательно во 2-й, 3-й и 4-й чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующих - изолированные колонии.
Метод истощающего штриха. Рассевать накопительную культуру можно петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности плотной среды проводят штрихи в таком порядке, как указано на рисунке 4. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки [39].
После посева чашки помещают в термостат крышками вниз чтобы конденсационная вода, на крышке чашки Петри при застывании агара, не помешала получить образовавшаяся изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов.
Скорость роста УОМ достаточно высока и составляет 1-2 суток. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды.
Культуры УОМ поддерживали и сохраняли путем пересева через 1-2 месяца на МПА - скошенный агар и содержания при температуре не выше 10° С.
Метод посева, используемый на скошенном агаре, называется посев «штрихом». В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская её до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара.
Морфо-культуральные свойства микроорганизмов определяли традиционными микробиологический методами - метод микроскопирования, приготовление микробиологических препаратов с простым и дифференцированным окрашиванием (метод окраски по Граму).
Микробиологический препарат «раздавленная капля» представляет собой изучение живых клеток микроорганизмов методом раздавленной капли, предварительно проводят окрашивание объекта прижизненными красителями - витальная окраска (красители: метиленовый синий, нейтральный красный). Препараты микроскопируют. Вначале пользуются малым увеличением - объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х). В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой. При использовании иммерсионного объектива на предметное стекло наносят каплю кедрового масла и микроскопируют [40].
«Фиксированный препарат» предполагает такую обработку живых клеток, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Прокаленной бактериологической петлей из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см2. Мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Высушенный препарат фиксируют. Препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки. На мазок наносят несколько капель красителя. Продолжительность окрашивания от 1-2 мин. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.