Рис. 6 Влияние кверцетина на моторные компоненты NMDA-индуцированных судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) после теплового прекондиционирования у крыс линии Вистар.
Обозначения:
«контрольный р-р+нембутал+NMDA» - крысы, которым за 24 ч до инъекции NMDA в/б вводили растворитель кверцетина и нембутал (n=5);
«ТП+NMDA» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения NMDA (n=9);
«кверцетин+ТП+NMDA» - крысы, которым вводили NMDA через 24 ч после теплового прекондиционирования, проведенного через 4 ч после введения кверцетина (n=5).
Решетками отмечены статистически значимые различия между группами «ТП+NMDA» и «кверцетин+ТП+NMDA. # - при уровне значимости p<0.05, ## - при уровне значимости p<0.01.
В модели коразоловых судорог введение кверцетина за 4 ч до теплового прекондиционирования, также как и при NMDA-индуцированных судорогах, усиливало тяжесть судорожного припадка. Об этом свидетельствовали снижение латентного периода судорог в 2 раза (р<0.05) и увеличение длительности тонических судорог в 1.4 раза (р<0.05) по сравнению с тепловым прекондиционированием (рис. 7 А). Тяжесть коразоловых судорог увеличивалась (рис. 7 Б) за счет увеличения количества животных с тоническими судорогами (на 36%, р<0.05) и увеличения гибели животных (на 46%, р<0.05). При введении кверцетина за 4 ч до теплового прекондиционирования наблюдалось увеличение на 36% (р<0.05) количества крыс с симптомами атаксии, их длительности (в 1.3 раза, р<0.05) и тяжести. Практически у всех животных симптомы атаксии проявлялись неспособностью к перемещению или бочкообразными движениями, чего не наблюдалось в группе с тепловым прекондиционированием.
Рис. 7 Влияние кверцетина на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) после теплового прекондиционирования у крыс линии Вистар.
Обозначения:
«контрольный р-р+нембутал+ коразол» - крысы, которым за 24 ч до инъекции коразола в/б вводили растворитель кверцетина и нембутал (n=7);
«ТП+ коразол» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения коразола (n=10);
«кверцетин+ТП+коразол» - крысы, которым вводили коразол через 24 ч после теплового прекондиционирования, проведенного через 4 ч после введения кверцетина (n=7).
Решеткой отмечены статистически значимые различия между группами «ТП+коразол» и «кверцетин+ТП+коразол» при уровне значимости p<0.05.
Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что основной вклад в противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования вносит индуцибельный белок Hsp70i, содержание которого значительно возрастает после теплового прекондиционирования в лимбических структурах головного мозга, вовлеченных в инициацию и поддержание генерализованных судорог. Противосудорожные эффекты Hsp70i могут быть связаны с его способностью модулировать пресинаптические процессы передачи сигнала в головном мозге. В пользу данного предположения указывают электрофизиологические исследования, выполненные на слайсах продолговатого мозга мыши и нервно-мышечном соединении личинки Drosophila, в которых показано, что тепловое прекондиционирование защищало синаптическую передачу от повреждающего действия высоких температур путем модулирования пресинаптических процессов высвобождения нейромедиаторов [Karunanithi et al., 1999; Kelty et al., 2002].
4. Изучение противосудорожных эффектов препарата Hsp70
Увеличения содержания Hsp70i в структурах головного мозга можно достичь также путем введения в ликворную систему мозга препарата Hsp70 [Ekimova et al., 2010]. Проведенное исследование показало, что введение препарата Hsp70 в ликвор 3-го ж.м. увеличивало латентный период судорожного припадка в 1.2 раза (р<0.05) и в 1.7 раз (р<0.05) укорачивало длительность клонических судорог по сравнению с контролем (рис. 8 А). Количество животных с тоническими судорогами уменьшалось на 45% (р<0.05). Экзогенный Hsp70, как и тепловое прекондиционирование, понижал смертность крыс на 45% (р<0.05) и тяжесть судорог (рис. 8 Б). Отмечено уменьшение числа крыс с симптомами атаксии на 45% (р<0.05) и ослабление их тяжести. Симптомы атаксия проявлялись в виде резких, неуклюжих движений и редких заваливаний на бок. Введение растворителя Hsp70 (фосфатный буфер) и термоденатурированного Hsp70 в 3-й ж.м. крыс не оказывало влияния на моторные компоненты коразоловых судорог и послесудорожные двигательные нарушения.
Рис. 8 Влияние экзогенного Hsp70 на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.
Обозначения:
«фосфатный буфер+коразол» - крысы, получавшие инъекцию фосфатного буфера в 3-й ж.м. за 2 ч до в/б введения коразола (n=9);
«Hsp70+коразол» - крысы, которым за 2 ч до введения коразола делали микроинъекцию Hsp70 в 3-й ж.м. (n=11).
Таким образом, увеличение содержания в мозге экзогенного Hsp70i (при введении его в 3-й ж. м.) оказывает сходный с тепловым прекондиционированием противосудорожный эффект в модели коразоловых судорог. Эти данные являются еще одним подтверждением противосудорожного действия белка теплового шока 70 кДа в модели генерализованной эпилепсии.
5. Исследование белок-белкового взаимодействия экзогенного индуцибельного Hsp70i с синаптофизином и глутаматдекарбоксилазой 67
С помощью метода конфокальной микроскопии недавно показано, что меченый флуоресцентным красителем препарат Hsp70, введенный в 3-й ж.м. крыс, способен проникать в структурные элементы мозга [Ekimova et al., 2010]. В гиппокампе экзогенный Hsp70 колокализовался с белком-катализатором синтеза ГАМК, глутаматгидроксилазой 67 (ГДК 67), и белком синаптических везикул, синаптофизином. Эти данные позволили предположить, что Hsp70 может физически связываться с синаптофизином и ГДК 67. С помощью метода ко-иммунопреципитации выяснено, что в гиппокампе экзогенный индуцибельный Hsp70i взаимодействует с синаптофизином (рис. 9), о чем свидетельствовало появление в преципитате Hsp70i (верхняя панель рис. 9) и синаптофизина (нижняя панель рис. 9). Синаптофизин и Hsp70i присутствовали также в супернатанте (фракция белков лизата, не связавшихся с антителами против синаптофизина или экзогенного Hsp70i). Это свидетельствует об избыточном количестве Hsp70i и синаптофизина в инкубационной смеси.
Рис. 9 Экзогенный индуцибельный Hsp70i вступает в белок-белковое взаимодействие с синаптофизином в гиппокампе крыс.
Верхняя панель рис.: после иммунопреципитации с антителами против синаптофизина белковые комплексы осаждали белок-G- агарозой
и анализировали методом ИБ с антителами против экзогенного Hsp70i
Нижняя панель рис.: после иммунопреципитации с антителами против экзогенного Hsp70i белковые комплексы осаждали белок-G- агарозой и анализировали методом ИБ с антителами против синаптофизина
Сокращения здесь и на рис. 10:
ИП - иммунопреципитат
ИБ - иммуноблоттинг
Выявлено, что экзогенный Hsp70i способен вступать во взаимодействие и с ГДК 67 в гиппокампе крыс. На это указывало появление в преципитате Hsp70i (рис. 10). На рис. 10 видно, что Hsp70i присутствует также в супернатанте, что указывает на избыточное количество Hsp70i в инкубационной смеси. Эти данные позволили предположить, что синаптофизин и ГДК 67 - ключевые мишени противосудорожного действия индуцибельного Hsp70i.
Рис. 10 Экзогенный индуцибельный Hsp70i вступает в белок-белковое взаимодействие с ГДК 67 в гиппокампе крыс.
На рис. 10: после иммунопреципитации с антителами против ГДК 67 белковые комплексы осаждали белок-G- агарозой и анализировали методом ИБ с антителами против экзогенного Hsp70i
Таким образом, в ходе работы получены новые данные о том, что ингибитор экспрессии Hsp70i кверцетин, вызывающий уменьшение содержания Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга (гиппокамп, таламус), оказывал проконвульсантное действие в моделях генерализованной эпилепсии. Тепловое прекондиционирование, увеличивавшее содержания Hsp70i в структурах головного мозга, вовлеченных в генерацию и поддержание судорожной активности (гиппокамп, пириформная кора, миндалина, гипоталамус, таламус, средний мозг), напротив, оказывало противосудорожное действие и снижало послесудорожные двигательные нарушения, вызванные NMDA и коразолом. В условиях действия ингибитора экспрессии Hsp70i кверцетина, тепловое прекондиционирование не вызывало увеличения содержание Hsp70i в структурах головного мозга крыс и не оказывало противосудорожного действия в моделях генерализованной эпилепсии. Эти данные указывают на то, что противосудорожное действие теплового прекондиционирования связано с увеличением содержания индуцибельного Hsp70i в структурах головного мозга, «критических» для реализации судорожной активности. В пользу данного предположения свидетельствуют и данные, полученные при введении экзогенного Hsp70 в 3-й ж.м. крыс. Экзогенный Hsp70 оказывал противосудорожное действие, сходное с тепловым прекондиционированием. В ходе исследования выяснено, что в гиппокампе молекулярными мишенями противосудорожного эффекта Hsp70i могут являться везикулярный белок синаптофизин и ключевой фермент синтеза ГАМК, ГДК 67. Можно полагать, что противосудорожное действие Hsp70i связано с его способностью вовлекаться в молекулярные механизмы модуляции экзоцитоза синаптических везикул и функции фермента синтеза ГАМК, ГДК 67, в интернейронах гиппокампа. Возникновение судорожного синдрома связано с нарушением баланса между возбуждающими и тормозными процессами в мозге. По-видимому, увеличение содержания Hsp70i в головном мозге, достигнутое тепловым прекондиционированием или введением препарата Hsp70 в 3-й ж.м., усиливает ГАМК-связанные пресинаптические механизмы передачи тормозного сигнала в ЦНС. Эти тормозные механизмы являются ключевыми в процессах снижения активности возбуждающих систем и проявления противосудорожного эффекта Hsp70i в моделях генерализованной эпилепсии.
Выводы
1. Ингибитор экспрессии Hsp70i кверцетин увеличивает а) длительность тонического компонента судорог, тяжесть припадка и послесудорожных симптомов атаксии в модели NMDA-индуцированных судорог и б) длительность не только тонического, но и клонического компонента в модели коразоловых судорог; этим проконвульсантным эффектам кверцетина в обеих моделях генерализованных судорог у крыс соответствует по срокам (через 4 часа) уменьшение содержания шаперона Hsp70i в гиппокампе, таламусе и в плазме крови.
2. Кратковременное (в течение 10 мин) тепловое прекондиционирование в обеих моделях судорог вызывает увеличение латентного периода судорожной активности и ослабление тяжести судорожного припадка и послесудорожных симптомов атаксии; эти противосудорожные эффекты совпадают по срокам (через 24 ч) с повышением содержания шаперона Hsp70i в структурах мозга, участвующих в реализации генерализованных судорог (гиппокамп, пириформная кора, миндалина, гипоталамус, таламус, средний мозг).
3. В обеих моделях судорог введение кверцетина за 4 часа до теплового прекондиционирования предотвращает вызываемые им противосудорожные эффекты и повышение содержания Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга (гиппокампе, пириформной коре, миндалине, гипоталамусе, таламусе, среднем мозге).
4. Введение препарата Hsp70 в ликвор третьего желудочка мозга в модели коразоловых судорог вызывает противосудорожный эффект, сходный с тепловым прекондиционированием (увеличение латентного периода судорог, ослабление тяжести припадка и послесудорожных симптомов атаксии), а также отчетливое уменьшение длительности клонических судорог.
5. Индуцибельный белок Hsp70i вступает в межмолекулярное взаимодействие с везикулярным белком синаптофизином и ферментом синтеза ГАМК, глутаматдекарбоксилазой 67 (ГДК67), в гиппокампе крыс. Синаптофизин и ГДК67 являются молекулярными мишенями противосудорожного действия Hsp70i.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в рецензируемых журналах
Екимова И.В., Комарова Т.Г., Ницинская Л.Е., Пастухов Ю.Ф., Гужова И.В. Эффекты экзогенного белка теплового шока 70 кДа и кверцетина на NMDA- индуцированные судороги // Докл. РАН - 2008. - T. 418. - № 5. - С. 705-708.
Ницинская Л. Е., Екимова И. В., Гужова И. В., Фейзулаев Б. А., Пастухов Ю.Ф. Влияние кверцетина на тяжесть химически индуцированных судорог и содержание белка теплового шока 70 кДа в структурах головного мозга крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2010. - T. 96. - № 3. - С. 283-292.
Ekimova I.V., Nitsinskaya L.E., Romanova I.V., Pastukhov Yu.F., Margulis B.A., Guzhova I.V. Exogenous protein Hsp70 can penetrate into the brain structures and attenuate the severity of chemically-induced seizures. J. Neurochem. - 2010. - V. 115. - № 4. - P. 1035-1044.
Статьи в сборниках научных работ
1. Екимова И.В., Ницинская Л.Е., Комарова Т.Г., Пастухов Ю.Ф., Гужова И.В. Роль белка стресса в механизмах развития судорожных состояний // Стресс и висцеральные системы. - Мн: ПЧУП “Бизнесофсет”. - 2005. - С. 80-84.
2. Ницинская Л.Е., Худик К.А., Пастухов Ю.Ф. Влияние теплового прекондиционирования на судорожную активность на разных моделях экспериментальной эпилепсии у крыс // Медико-биологические аспекты действия физических факторов. - Мн: ПЧУП “Бизнесофсет”. - 2006. - С. 181-184.
1. Pastukhov Iu. F., Komarova T. G., Nitsinskaya L. E., Ekimova I. V. Effects of HSP70 on NMDA-induced seizure in rats // Abstr. of the IXth Conference «Stress and Behavior». Psychopharmacology & biological narcology. - St.-Petersburg. - 2005. - P. 900.
2. Chernyshev M.V., Nitsinskaya L.E. An inhibitor of HSP expression quercetin does not alter open field behavior in rats predisposed to audiogenic seizures // Abstr. of the IXth Conference «Stress and Behavior». Psychopharmacology & biological narcology. - St.-Petersburg. - 2005. - P. 123.
3. Комарова Т. Г., Ницинская Л. Е. Влияние белка теплового шока 70кДа и кверцетина на поведение белых крыс при гиперактивации NMDA типа глутаматных рецепторов // Тез. Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». - Вестник молодых ученых. - Санкт-Петербург. - 2005. - С. 56.
4. Ницинская Л.Е. Влияние теплового прекондиционирования на судорожную активность, вызванную пентилентетразолом // Материалы 9-ой Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2006. - С. 152-153.
5. Ницинская Л.Е., Худик К.А. Изучение противосудорожных эффектов Hsp70 у крыс линии Wistar и Крушинского-Молодкиной // Материалы 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2007. - С.309-310.
6. Екимова И.В, Пастухов Ю.Ф., Комарова Т.Г., Ницинская Л.Е. Шапероны в регуляции судорожной активности // Материалы XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва. - 2007. - С. 35-36.
7. Ekimova I.V., Nitsinskaya L.E., Pastukhov Iu.F., Guzhova I.V. Study of effects of thermal preconditioning and quercetin on seizure activity and content of heat shock protein 70 kDa in blood plasma in Wistar rats // Abstr. of the 10th Jubilee Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry «Stress and behavior». - St.-Petersburg. - 2007. - P. 22.
8. Ницинская Л.Е. Влияние теплового прекондиционировния на содержание Hsp70 кДа в структурах головного мозга и на коразол-индуцированную судорожную активность // Материалы 11-ой Всероссийской медико-биологической конференции «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2008. -. С.262-263.