Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Для сравнения 2-х независимых групп животных по количественному признаку использовали t-критерий Стьюдента (при нормальном распределении), U-критерий Манна-Уитни (при ненормальном распределении). При проведении анализа качественных признаков в 2 независимых группах (анализ таблиц 2 х 2) применяли точный критерий Фишера. Различия полученных результатов считались статистически достоверными при уровне значимости p<0.05.
Результаты исследования и их обсуждение
1. Влияние кверцетина на содержание Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга, а также на поведенческие показатели генерализованных судорог у крыс линии Вистар.
В контрольных условиях содержание Hsp70i в плазме крови крыс Вистар составляет в среднем 5±0.9 нг/мл. Введение растворителя кверцетина не влияло на уровень Hsp70i в плазме крови. Через 4 ч после в/б введения кверцетина у 100% крыс содержание Hsp70i в плазме крови было ниже определяемого уровня.
Из данных литературы известно, что в механизмы генерации и поддержания NMDA-индуцированных и коразоловых судорог вовлечены пириформная кора, миндалина, гиппокамп, гипоталамус, таламус, средний мозг, ядра мозжечка и др. структуры [Avoli et al., 2002; Valisek et al., 2007; Miller et al., 1987; Snyder-Keller, Keller, 2001; Brevard et al., 2006]. Поэтому при изучении содержания Hsp70i в головном мозге именно этим структурам уделялось особое внимание. Методом иммуноблоттинга выяснено, что через 4 ч после введения кверцетина содержание Hsp70i снижалось в гиппокампе и таламусе по сравнению с контролем (в/б введение растворителя кверцетина). В миндалине, гипоталамусе, пириформной коре, мозжечке и среднем мозге содержание Hsp70i не изменялось.
Введение NMDA крысам Вистар приводило с латентным периодом 6 ± 0.6 с к развитию «дикого» бега (длительностью 24 ± 1.7 с). Фаза «дикого» бега у 86% животных заканчивалась клоническими судорогами (12 ± 1.3 с), которые у 33% крыс переходили в фазу тонических судорог (3 ± 0.9 с). Общая длительность судорожного припадка составляла 36 ± 2.2 с. Судороги, индуцированные NMDA, вызывали гибель у 13% крыс. Тяжесть припадка составляла 3.8 балла. После окончания генерализованных судорог у 43% животных наблюдались симптомы атаксии (продолжительностью 82 ± 15.6 с), которые проявлялись неуклюжими и резкими движениями, потерей баланса при вставании на задние лапы, редкими заваливаниями на бок. Тяжесть симптомов атаксии составляла 2.5 балла. Ротационный синдром длительностью 27 ± 5.1 с наблюдался у 64% животных. Введение растворителя кверцетина за 4 ч до инициации судорог не влияло на моторные компоненты NMDA-индуцированных судорог и послесудорожные двигательные нарушения.
Установлено, что NMDA-индуцированные судороги не вызывали изменения содержания Hsp70i в плазме крови крыс Вистар. Анализ содержания Hsp70i в структурах головного мозга выявил, что через 24 ч после NMDA-индуцированных судорог уровень Hsp70i увеличивался в гиппокампе и не изменялся в пириформной коре, миндалине и гипоталамусе по сравнению с контролем (микроинъекция фосфатного буфера в 3-й ж.м.).
Введение кверцетина за 4 ч до введения NMDA увеличивало длительность тонических судорог в 4.3 раза (р<0.05) (рис. 1 А) и общую длительность судорожного припадка в 1.2 раза (р<0.05) (рис. 1 А) по сравнению с контролем. Несмотря на усиление тяжести судорожного припадка (рис. 1 Б) (преимущественно за счет возрастания на 30% (р<0.05) числа крыс с наиболее опасными для жизни тоническими судорогами), ни одно животное при введении кверцетина не погибало. В период после окончания судорожного припадка наблюдалось увеличение на 62% (р<0.05) числа крыс с симптомами атаксии, их средней длительности в 7 раз (р<0.05) и тяжести (практически у всех животных выявлялись бочкообразные движения или полная неспособность к перемещению). Увеличивалось число крыс с ротационным синдромом (на 20%) и повышалась его средняя длительность в 1.9 раз (р<0.05) по сравнению с контролем.
Рис. 1 Влияние кверцетина на моторные компоненты NMDA-индуцированных судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.
Здесь и на рисунках 2, 4-8 данные на рисунке А представлены как среднее арифметическое ± ошибка среднего; данные на рисунке Б представлены в виде усредненных значений баллов.
Обозначения:
«контрольный р-р+NMDA» - крысы, которым за 4 ч до инъекции NMDA в/б вводили растворитель кверцетина (n=8)
«кверцетин+NMDA» - крысы, которым за 4 ч до инъекции NMDA в/б вводили кверцетин (n=10)
Здесь и на последующих рисунках звездочками отмечены статистически значимые различия между экспериментальной и контрольной группами: * - при уровне значимости p<0.05, ** - при уровне значимости p<0.01.
Введение крысам линии Вистар коразола приводило с латентным периодом 42 ± 1.9 с к развитию судорожного припадка, начинавшегося с отдельных подергиваний скелетной мускулатуры туловища и развития орально-лицевых судорог. После этого у всех исследуемых животных следовала фаза клонических судорог (длительностью 12 ± 0.9 с), а затем у 90% - фаза тонических судорог (10 ± 1.2 с). Коразоловые судороги вызывали смерть у 90% крыс. Тяжесть припадка составляла 6 баллов. После окончания судорожного припадка у 90% животных наблюдались двигательные нарушения в виде симптомов атаксии (продолжительностью 1233 ± 63.2 с и тяжестью в 4.9 баллов), которые проявлялись в виде значительного ухудшения антигравитационных рефлексов, полной неспособности к перемещению. Введение растворителя кверцетина за 4 ч до инициации судорог не изменяло поведенческих показателей коразоловых судорог.
Коразоловые судороги, как и NMDA-индуцированные судороги, не влияли на содержание Hsp 70i в плазме крови крыс. Через 6 ч после окончания коразоловых судорог содержание Hsp70i увеличивалось в гиппокампе, а через 24 ч - в гиппокампе и мозжечке и не изменялось в остальных исследованных структурах по сравнению с контролем (в/б инъекция физиологического раствора).
Введение кверцетина увеличивало длительность клонических судорог в 2 раза (р<0.05) (рис. 2 А), а тонических - в 1.4 раза (р<0.05) (рис. 2 А). Блокада экспрессии Hsp70i кверцетином не влияла на гибель животных и тяжесть судорожного припадка по сравнению с контролем (рис. 2 Б). Изменений числа животных с симптомами атаксии, их длительности и тяжести не обнаружено.
Рис. 2 Влияние кверцетина на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.
Обозначения:
«контрольный р-р+ коразол» - крысы, которым за 4 ч до инъекции коразола в/б вводили растворитель кверцетина (n=9)
«кверцетин+коразол» - крысы, которым за 4 ч до инъекции коразола в/б вводили кверцетин (n=11)
Увеличение длительности моторных компонентов судорожных припадков и послесудорожных двигательных нарушений, выявляемое в те же сроки, что и уменьшение содержания Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга, свидетельствует о возможном вовлечении шаперона Hsp70i в центральные механизмы регуляции генерализованных судорог. Снижение уровня Hsp70i в гиппокампе и таламусе, нейроны и нервные сети которых включены в механизмы инициации и поддержания эпилептиформной активности мозга [Avoli et al., 2002; Brevard, et al., 2006], по-видимому, приводит к усилению нарушений синаптических процессов в этих структурах, вызванных NMDA или коразолом, и, как следствие, к увеличению тяжести судорожного синдрома и послесудорожных двигательных нарушений. Основанием для данного предположения послужили исследования, в которых показано, что Hsp70 вовлечен в молекулярные механизмы экзоцитоза [Swaine et al., 2006] и клатрин-зависимого эндоцитоза синаптических везикул [Ungewickell et al., 1995, Morgan et al., 2001], а также модулирования работы N-типа Са2+ каналов [Natochin et al., 2005; Miller et al., 2003].
2. Исследование эффектов теплового прекондиционирования на поведенческие показатели NMDA-индуцированных и коразоловых судорог и содержание Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга
Чтобы определить способность эндогенного белка Hsp70i оказывать противосудорожное действие в моделях генерализованной эпилепсии у крыс, представлялось важным исследовать влияние увеличения его содержания в головном мозге на судорожную активность и послесудорожные двигательные нарушения, индуцированные NMDA и коразолом. Для увеличения содержания Hsp70i в головном мозге использовали краткосрочное тепловое прекондиционирование крыс, которое, как известно, вызывает увеличение экспрессии и содержания белков теплового шока, в том числе и Hsp70i, в различных структурах мозга [Manzerra et al., 1997; Leoni et al., 2000]. Поскольку тепловое прекондиционирование проводилось в условиях нембулового наркоза, были выполнены контрольные серии экспериментов по изучению эффекта нембутала на исследуемые показатели через 24 ч с момента его введения.
Наше исследование показало, что введение нембутала не влияло на содержание Hsp70i в плазме крови крыс Вистар. Через 15 мин после теплового прекондиционирования содержание Hsp70i в плазме крови увеличивалось в 4.5 раз (р<0.01), а к 60 мин снижалось до контрольных значений. Через 6 ч после теплового прекондиционирования содержание Hsp70i увеличивалось в пириформной коре, таламусе, гипоталамусе, гиппокампе, среднем мозге и мозжечке и не изменялось в миндалине, по сравнению с контролем (рис. 3). Через 24 ч после теплового прекондиционирования содержание Hsp70i увеличивалось во всех исследованных структурах (рис. 3).
Рис. 3 Влияние теплового прекондиционирования на содержание индуцибельного белка теплового шока 70 кДа (Hsp70i) в структурах головного мозга крыс линии Вистар. Обозначения: «К 6 ч», «К 24 ч» - в/б введение нембутала контрольным крысам за 6 ч и 24 ч до декапитации, соответственно; «ТП 6 ч», «ТП 24 ч» - крысы, которых декапитировали через 6 ч и 24 ч после теплового прекондиционирования, соответственно.
Выяснено, что введение нембутала не влияло на поведенческие компоненты NMDA-индуцированных судорог и послесудорожные двигательные нарушения. Проведение процедуры теплового прекондиционирования под нембуталовым наркозом увеличивало латентный период «дикого» бега (в 14 раз, р<0.01), снижало длительность клонических судорог (в 1.9 раза, р<0.05) и общую длительность судорожного припадка (в 1.5 раз, р<0.05) по сравнению с контролем (рис. 4 А). Тяжесть судорог после теплового прекондиционирования снижалась (рис. 4 Б) преимущественно за счет сокращения на 56% (р<0.05) количества крыс с клоническими судорогами. Обнаружено уменьшение в 2 раза числа крыс с симптомами атаксии (р<0.05) и ослабление их тяжести. В отличие от контрольной группы, симптомы атаксии после теплового прекондиционирования проявлялись в виде необычных, неуклюжих и резких движений. Количество животных с ротационным синдромом и его длительность не изменялись.
Рис. 4 Влияние теплового прекондиционирования на моторные компоненты NMDA-индуцированных судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.
Обозначения:
«нембутал+NMDA» - контрольные крысы, подвергавшиеся нембуталовому наркозу за 24 ч до введения NMDA (n=5);
«ТП+NMDA» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения NMDA (n=9).
Показано, что инъекция нембутала не изменяла моторные компоненты судорог и послесудорожные симптомы атаксии, вызванные коразолом. Процедура теплового прекондиционирования в 1.8 раз (р<0.05) увеличивала латентный период коразоловых судорог и снижала тяжесть судорожного припадка по сравнению с контролем (рис. 5 А, Б). Снижение тяжести коразоловых судорог происходило за счет уменьшения числа животных с тоническими судорогами (на 50%, р<0.05) и снижения смертности (на 50%, р<0.05). Тепловое прекондиционирование вдвое (р<0.05) сокращало число животных с симптомами атаксии, их длительность (в 1.4 раза, р<0.05) и тяжесть. После теплового прекондиционирования животные уже могли поддерживать баланс во время вставания на лапы, однако, сохранялись резкие и неуклюжие движения.
Рис. 5 Влияние теплового прекондиционирования на моторные компоненты коразоловых судорог (А) и на тяжесть судорожного припадка (Б) у крыс линии Вистар.
Обозначения:
«нембутал+коразол» - контрольные крысы, подвергавшиеся нембуталовому наркозу за 24 ч до введения коразола (n=9);
«ТП+коразол» - крысы, подвергавшиеся тепловому прекондиционированию за 24 ч до введения коразола (n=10).
Полученные данные свидетельствуют, что при инициации NMDA и коразоловых судорог на сроках, совпадающих с увеличением содержания Hsp70i в структурах лимбической системы, наблюдается увеличение латентного периода судорожного припадка, уменьшение его тяжести и послесудорожных симптомов атаксии. Эти данные позволили нам высказать гипотезу, что основной вклад в противосудорожные эффекты теплового прекондиционирования вносит индуцибельный белок Hsp70i.
3. Влияние кверцетина на поведенческие показатели судорожной активности в моделях генерализованных судорог и на уровень Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга после теплового прекондиционирования
Поскольку тепловое прекондиционирование вызывает экспрессию не только Hsp70i, но и других членов семейств белков теплового шока [Bechtold, Brown, 2003; Kim et al., 2004], которые могут обладать и антагонистическими свойствами, представлялось важным изучить влияние ингибитора экспрессии Hsp70i кверцетина на поведенческие показатели судорожной активности в моделях NMDA-индуцированных и коразоловых судорог и на уровень Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга после теплового прекондиционирования. Проведенное исследование показало, что введение кверцетина за 4 ч до теплового прекондиционирования предотвращало вызываемые им противосудорожные эффекты и повышение содержания Hsp70i в плазме крови и структурах головного мозга (пириформной коре, гиппокампе, миндалине, гипоталамусе, таламусе, среднем мозге). В этих опытах отмечено утяжеление судорожного припадка, вызванного введением NMDA. Об этом свидетельствовали: уменьшение латентного периода «дикого» бега в 12 раз (р<0.01), увеличение длительности клонических судорог в 1.7 раз (р<0.05) и общей длительности судорожного припадка в 1.5 раза (р<0.05) по сравнению с группой животных, которых подвергали тепловому прекондиционированию (рис. 6 А). При этом число крыс с клоническими судорогами возрастало на 56% (р<0.05) и тяжесть припадка увеличивалась (рис. 6 Б). После окончания судорог наблюдалось увеличение числа крыс с симптомами атаксии (на 78%, р<0.05), их длительности (в 2 раза, р<0.05) и тяжести по сравнению с тепловым прекондиционированием и контролем (в/б растворитель кверцетина, через 4 ч - введение нембутала). Практически у всех животных выявлялись бочкообразные движения или полная неспособность к перемещению. Количество животных с ротационным синдромом и его длительность не изменялись.