Автореферат: Изучение элементов скрытого метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

Определение АЛС активности в штамме B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH, несущем плазмиду pMIV5JS-ilvIH^Mme, показало, что AHAS M. methylotrophus подвержена ингибированию валином, но профиль ингибирования отличен от AHAS III E. coli (Рис. 12). Можно видеть, что для AHAS M. methylotrophus снижение относительной АЛС активности на 50% наблюдалось при добавлении 20 мМ валина, тогда как для AHAS III E. coli - при добавлении 0.05 мМ валина.

Впоследствии было установлено, что устойчивость клеток M. methylotrophus к валину связана не с валин-устойчивостью AHAS, а с отсутствием у этих бактерий систем транспорта разветвленных аминокислот в клетку (к.б.н. Йомантас Ю.В., ЗАО “АГРИ”).

Некоторые из полученных на данном этапе работы конструкций использовались при создании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Рис. 12. Ингибирование AHAS M. methylotrophus (А) и AHAS III E. coli (В) валином. Удельная АЛС активность в клетках в отсутствие валина принята за 1;

Изучение образования норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма E. coli, дефектного по AHAS

Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH

Еще одним примером “скрытого” метаболизма 2-кетобутирата, с которым мы столкнулись в рамках этой работы, оказался синтез неканонических аминокислот норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH - производном штамма E. coli K-12 В7, в котором делетированы все гены, кодирующие изоферменты AHAS. Данный штамм является ауксотрофом по изолейцину и валину, но не требует добавления лейцина для роста на минимальной среде, поскольку лейцин синтезируется из продукта дезаминирования валина - 2-кетоизовалерата (Рис. 13).

Мы обнаружили, что штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH при культивировании в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л) в отсутствие лейцина накапливал в культуральной жидкости вещества, которые методом ВЭЖХ-МС были идентифицированы как норвалин и норлейцин [Новикова и др, 2006]. Содержание норлейцина и норвалина в культуральной жидкости было определено методом ОФ-ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием (Табл. 10). Суммарный выход норвалина и норлейцина из глюкозы для штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH составил около 5%.

Таблица 10. Накопление норвалина и норлейцина клетками штаммов E. coli B7 и B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH*

* Клетки растили в среде состава: глюкоза (60 г/л), (NH₄)₂SO₄ (18 г/л), K₂HPO₄·3H₂O (2 г/л), MgSO₄·7H₂O (1 г/л), CaCO₃ (25 г/л), тиамин (0.02 г/л);

** Изолейцин добавляли до конечной концентрации 100 мг/л, валин - 100 мг/л.

Механизм образования норвалина и норлейцина впервые был предложен для Serratia marcesсens [Kisumi et al., 1976]. Полагают, что норвалин и норлейцин синтезируются из 2-кетобутирата и 2-кетовалерата, соответственно, в так называемом “пути удлинения кетокислот” (Рис. 13). Ферменты данного пути - изопропилмалатсинтаза (IPMS, продукт гена leuA), изопропилмалатизомераза (IPMI, продукт генов leuCD) и изопропилмалатдегидрогеназа (IPMD, продукт гена leuB) в норме осуществляют удлинение углеродной цепи 2-кетоизовалерата на одну метиленовую группу с образованием 2-кетоизокапроата - предшественника лейцина. Известно, что IPMS S. marcesсens способна использовать в качестве субстрата не только 2-кетоизовалерат, но и с другие кетокислоты, в частности, 2-кетобутират и 2-кетовалерат. Продукты реакции метаболизируются IPMI и IPMD, которые также обладают широкой субстратной специфичностью. В результате из 2-кетобутирата в первом цикле “пути удлинения кетокислот” образуется 2-кетовалерат, который превращается в 2-кетокапроат во втором цикле этого пути. Аминирование 2-кетовалерата и 2-кетокапроата аминотрансферазами IlvE, AvtA или TyrB приводит к образованию норвалина и норлейцина, соответственно.

Рис. 13. Предполагаемая схема биосинтеза норлейцина и норвалина в S. marcesсens и E. coli

Pyr - пируват

Существует ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что у E. coli, так же, как и у S. marcesсens, синтез норвалина и норлейцина осуществляется в пути биосинтеза лейцина [Bogosian et al., 1989]. Полученные нами данные по накоплению норвалина и норлейцина клетками штамма E. coli с блокированной функцией AHAS также подтверждают предполагаемый механизм. По-видимому, в условиях роста клеток в среде с низкой концентрацией валина (100 мг/л) в отсутствие лейцина уровень 2-кетоизовалерата, а значит и лейцина, в клетке снижен, что вызывает дерепрессию leuABCD оперона, а отсутствие AHAS приводит к значительному увеличению уровня 2-кетобутирата в клетке. В этих условиях IPMS вместо 2-кетоизовалерата может использовать 2-кетобутират, который находится в избытке, что приводит к образованию норвалина и норлейцина.

Известно, что норвалин и норлейцин относятся к антиметаболитам и ингибируют рост клеток E. coli дикого типа. Однако можно видеть, что штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH накапливает данные аминокислоты в количествах, превышающих их минимальные ингибирующие концентрации (Табл. 11). Мы предположили, что данное явление связано с тем, что в процессе ферментации в условиях сверхсинтеза норвалина и норлейцина накапливаются мутации, приводящие к устойчивости клеток к данным аминокислотам.

Таблица 11. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) норвалина и норлейцина для штаммов E. coli

B7

0.06

0.3

B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH

0.06

0.3

B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH*

0.06

0.3

*Штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH, отобранный после ферментации в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л).

Определение минимальных ингибирующих концентраций норвалина и норлейцина для штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH, отобранного после ферментации в среде с изолейцином (100 мг/л) и валином (100 мг/л) показало, что он не имеет фенотипа устойчивости к норвалину и норлейцину (Табл. 11). Следовательно, наше предположение оказалось неверным. Столь высокий уровень продукции данных аминокислот штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH возможно связан с тем, что в процессе ферментации активируются системы их транспорта из клетки.

Подтверждение предполагаемого механизма биосинтеза норвалина и норлейцина

Для подтверждения предполагаемого механизма биосинтеза неканонических аминокислот мы изучили влияние различных факторов на накопление норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH (Табл. 12). Из представленных данных видно, что добавление лейцина в среду культивирования предотвращало образование неканонических аминокислот вследствие ингибирования активности IPMS и репрессии leuABCD оперона. Аналогичный эффект наблюдался при добавлении валина в концентрации 500 мг/л, что обусловлено увеличением уровня 2-кетоизовалерата в клетке. Введение в штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH плазмиды pMIV-P_ilvIH-ilvIH, несущей гены AHAS III, восстанавливало утилизацию 2-кетобутирата и также предотвращало образование норвалина и норлейцина. Можно видеть, что амплификация лейцинового оперона дикого типа путем введения в штамм B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH плазмиды pBR-leuABCD (любезно предоставлена Сливинской Е.А., ЗАО “АГРИ”) приводила к двукратному увеличению уровня накопления норлейцина. Суммарный выход норвалина и норлейцина из глюкозы в данном случае составил около 8%.

Таблица 12. Продукция норвалина и норлейцина штаммом B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH и его производными

* Клетки растили в среде, содержащей 6% глюкозы, изолейцин добавляли до конечной концентрации 100 мг/л, валин - 100 мг/л, лейцин - 100 мг/л;

** Валин добавляли до конечной концентрации 500 мг/л.

Интересно отметить, что делеция гена ilvA, блокирующая образование 2-кетобутирата из треонина, не оказывала существенного влияния на накопление норвалина и норлейцина. Это указывает на то, что, в отсутствие треониндезаминазы, 2-кетобутират синтезируется не из треонина, а из пирувата ферментами биосинтеза лейцина (Рис. 13). Такой альтернативный путь образования 2-кетобутирата используется в некоторых организмах для треонин-независимого биосинтеза изолейцина [Howell et al., 1999, Xu et al., 2004].

Таким образом, полученные результаты согласуются с предложенной Кисуми схемой биосинтеза неканонических аминокислот.

Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками E. coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина

Для дополнительного доказательства того, что норвалин и норлейцин синтезируются из 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, мы изучили образование этих аминокислот из 2-кетобутирата покоящимися клетками штаммов с различным уровнем экспрессии leuABCD оперона: штамма B7 - с опероном leuABCD дикого типа; штаммов с усиленной экспрессией leuABCD оперона - B7 cat-P_L-leuABCD, содержащем лейциновый оперон под контролем P_L промотора фага , и B7 cat-P_L-leuA^G479CBCD, в котором ген leuA^G479C, кодирующий IPMS, устойчивую к ретроингибированию, а также остальные гены биосинтеза лейцина находились под контролем P_L промотора фага ; и штамма B7leuA, в котором ген leuA был делетирован (Табл. 13). Об уровне экспрессии leuABCD оперона судили по уровню активности IPMS.

Таблица 13. Образование норвалина (Nva) и норлейцина (Nle) покоящимися клетками E. coli с различным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина

Результаты проведенного опыта показали, что покоящиеся клетки штамма дикого типа накапливали норвалин только в присутствии экзогенного 2-кетобутирата, а делеция гена leuA блокировала образование норвалина. Наибольший уровень синтеза норвалина и норлейцина наблюдался для клеток штаммов с высоким уровнем активности IPMS, в особенности для штамма B7 cat-P_L-leuA^G479CBCD c IPMS устойчивой к ретроингибированию. Необходимо отметить, что покоящиеся клетки штаммов B7 cat-P_L-leuABCD и B7 cat-P_L-leuA^G479CBCD накапливали норвалин и норлейцин даже в отсутствие 2-кетобутирата, что можно объяснить их образованием из внутриклеточного пирувата.

Кроме того, как видно из Таблицы 13, покоящиеся клетки штаммов, имеющих функционально активные AHASы, при добавлении 2-кетобутирата предпочтительнее накапливают норвалин, тогда как в клетках штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH с блокированной функцией AHAS преимущественно образуется норлейцин (Табл. 10). Возможно, это связано с тем, что в клетках, имеющих функционально активные AHASы, уровень 2-кетоизовалериата выше, чем в клетках штамма, дефектного по AHAS, при добавлении валина в концентрации 100 мг/л. Поэтому 2-кетовалерат преимущественно вступает в реакцию аминирования с образованием норвалина, а не взаимодействует с IPMS, что приводит к образованию норлейцина.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что норвалин и норлейцин у E. coli действительно образуются из 2-кетобутирата в пути биосинтеза лейцина. Синтез этих неканонических аминокислот штаммом E. coli с блокированой функциией синтаз ацетогидроксикислот обусловлен увеличением уровня 2-кетобутирата в клетке, что в условиях дерепрессии лейцинового оперона приводит к утилизации 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина.