Автореферат: Изучение элементов скрытого метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), IPTG добавляли до конечной концентрации 1мМ;

** 2-AБ - 2-аминобутират.

Оказалось, что в условиях репрессии гена ilvA^IleR кроме треонина штамм накапливал небольшое количество пропионата, который обычно токсичен для клеток E. coli (Табл. 3). При индукции гена ilvA^IleR в условиях добавления экзогенного треонина уровень синтеза пропионата существенно увеличивался и происходило накопление 2-кето-3-метилвалерата (КМВ) - предшественника изолейцина, и 2-аминобутирата (2-АБ) - продукта аминирования 2-кетобутирата изолейцин-валиновыми аминотрансферазами.

Таблица 3. Некоторые продукты ферментации, накапливаемые штаммом ITP290-3 в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR (опыт 1) и в условиях экспрессии гена ilvA^IleR (опыт 2).

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), с добавками треонина (47.8 мМ) и IPTG (1мМ), либо без добавок.

Мы предположили, что пропионат мог быть как продуктом деградации 2-кетобутирата, который образуется из треонина под действием треониндезаминазы, так и изолейцина (Рис. 3). Деградация 2-кетобутирата представлялась нам наиболее вероятным путем синтеза пропионата, так как клетки E. сoli не способны катаболизировать углеродный скелет изолейцина, в частности, использовать его в качестве единственного источника углерода для роста. Для экспериментальной проверки данных схем мы изучили утилизацию треонина, равномерно меченого изотопом ¹⁴С, в штамме ITP290-3.

Рис. 3. Возможные пути синтеза пропионата в штамме ITP290-3

Анализ продуктов деградации треонина, однородно меченного изотопом ¹⁴С, в штамме ITP290-3

Деградация треонина изучалась нами путем анализа меченых продуктов утилизации L-[U-¹⁴C]треонина. С этой целью штамм ITP290-3 культивировали в среде с немеченой глюкозой в качестве источника углерода в присутствии L-[U-¹⁴C]треонина и немеченого треонина (5.7 г/л) в условиях репрессии и дерепрессии гена ilvA^IleR. Определение суммарной радиоактивности культуральной жидкости штамма ITP290-3, проведенное на разных этапах ферментации, показало, что в процессе ферментации происходило уменьшение суммарной радиоактивности культуральной жидкости, по-видимому, за счет выведения ¹⁴C-метки с летучими соединениями, главным образом, с ¹⁴CO₂ (Рис. 4). Можно видеть, что в условиях индукции треониндезаминазы количество метки, выводимой с летучими соединениями, было на 24 больше, чем в отсутствие индукции.

Мы провели количественный анализ распределения ¹⁴С-метки в продуктах ферментации штамма ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Оказалось, что только 38% ¹⁴С-метки, введенной с L-[U-¹⁴C]треонином, включалось в изолейцин, 5% метки включалось в 2-аминобутират, 34% составила потеря метки с летучими соединениями (Рис. 5). Таким образом, в условиях данного эксперимента нам удалось идентифицировать 43% меченых продуктов утилизации L-[U-¹⁴C]треонина. Для идентификации остальных продуктов деградации треонина мы изучили утилизацию треонина, равномерно меченого изотопом ¹³C, в штамме ITP290-3 с помощью ЯМР-спектроскопии. Все ЯМР-спектры были накоплены, обработаны и проанализированы в лаборатории спектрального анализа ИБХ РАН.

Рис. 5. Распределение ¹⁴C-меченных атомов в продуктах ферментации штамма ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR

Анализ продуктов деградации L-¹³C-треонина методом ЯМР-спектроскопии

Треонин, однородно меченный изотопом ¹³C, был получен путем культивирования треонинового продуцента TDH7KmS/pРRT614 в среде, содержащей D-[U-¹³C]глюкозу в качестве единственного источника углерода. В ¹H-ЯМР-спектре L-¹³C-треонина были обнаружены характерные сигналы протонов -CH группы при 4.28 м.д., -CH группы при 3.1 м.д. и -CH₃ группы при 1.35 м.д. (рис. не приводится). Интересно отметить, что C атом полученного L-¹³C-треонина был в меньшей степени обогащен изотопом ¹³C по сравнению с C и C атомами. Так, для C и C атомов соотношение изотопов ¹²C/¹³C составило 0.11, а для C атома - 0.20. Такая неоднородность мечения треонина, полученного микробиологическим способом из D-[U-¹³C]глюкозы, вероятно, связана с тем, что при образовании C атома оксалоацетата (и соответственно треонина) в фосфоенол-пируваткарбоксилазной реакции происходит ассимиляция не только меченого ¹³CO₂, выделяемого в реакциях декарбоксилирования, но и ¹²CO₂ из окружающей среды (Рис. 6).

Для изучения деградации L-¹³C-треонина мы проводили ферментацию штамма ITP290-3 в среде с немеченой глюкозой в присутствии L-¹³C-треонина (2 г/л) и немеченого треонина (8 г/л) в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR и в условиях экспресcии ilvA^IleR.

Рис. 6. Образование треонина из ¹³C-фосфоенолпирувата (PEP) и ¹²CO₂ Ppc - фосфоенолпируваткарбоксилаза (EC 4.1.1.31)

Продукты ферментации анализировали методами одномерной гомоядерной и двумерной (2D) гомо- и гетероядерной ЯМР-спектроскопии, которые в настоящее время широко применяются в исследованиях метаболических потоков, так позволяют проследить за метаболизмом ¹³C-меченных соединений [Szyperski et al., 1992, London et al., 1999].

На Рис. 7 приведены ¹H-ЯМР-спектры культуральной жидкости штамма ITP290-3 в условиях репрессии гена ilvA^IleR (спектр I) и в условиях экспресии гена ilvA^IleR (спектр II). В отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR в ¹H-ЯМР спектре культуральной жидкости были обнаружены сигналы от протонов треонина и пропионата. В случае экспрессии гена ilvA^IleR в ¹H-ЯМР спектре наблюдали сигналы, соответствующие протонам пропионата, 2-кетобутирата, 2-аминобутирата, пирувата, треонина и ацетата.

Общее содержание изотопа ¹³С в продуктах ферментации было определено из одномерных ¹³С-спектров. Суммарная потеря ¹³С-меченых атомов в ходе ферментации в условиях экспрессии гена ilvA^IleR была на 21% больше, чем в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR. Эти результаты хорошо согласуются с данными по убыли метки в процессе утилизации L-[U-¹⁴C]треонина (Рис. 4).

Мы провели анализ количественного распределения ¹³С-метки в основных веществах-метаболитах в условиях индукции треониндезаминазы (Табл. 4). Большая часть изотопа ¹³С обнаруживалась в пропионате (41% от суммарного количества ¹³C-метки в идентифицированных соединениях). Можно видеть, что в условиях данного опыта L-¹³C-треонин метаболизировался не полностью. Кроме того, среди меченых продуктов деградации L-¹³C-треонина был идентифицирован норвалин (количество метки в нем не определялось), возможный путь его синтеза будет рассмотрен в Разделе 4 автореферата.

Tаблица 4. Относительное содержание изотопа ¹³C в продуктах ферментации штамма ITP290-3 в условиях индукции гена ilvA^IleR

*суммарное содержание изотопа ¹³C в изолейцине принято за 1.

На данном этапе работы по характеру включения изотопа ¹³С в молекулу пропионата мы проверяли два возможных пути его образования, приведенные на Рис. 8.

Рис. 8. Возможные пути образования пропионата и 2-аминобутирата: путь 1 - пропионат образуется из 2-кетобутирата (2-КБ), путь 2 - пропионат образуется из изолейцина; - ¹³С-атомы, - ¹²С-атомы

В том случае, если пропионат образуется из L-¹³C-треонина, однородно меченого по всем четырем атомам углерода, то включение изотопа ¹³С произойдет во все атомы углерода пропионата (Рис. 8, схема 2). Если же пропионат образуется из изолейцина, селективно меченного изотопом ¹³С, то C и C атомы пропионата будут немечеными, так как в молекуле изолейцина они происходят из немеченого пирувата (Рис. 8, схема 2).

Для экспериментальной проверки данных схем был накоплен и проанализирован 2D ¹H-¹³C-COSY спектр культуральной жидкости штамма ITP290-3, выращенного в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Фрагмент ¹H-¹³C-COSY спектра и срезы для кросс-пиков изолейцина и треонина по ¹³C-направлению представлены на Рис. 9.

Низкая интенсивность и отсутствие расщепления сигналов С и C² атомов изолейцина свидетельствовали о природном содержании изотопа ¹³С (около 1%) в ядрах данных атомов, что подтверждало их образование из немеченого пирувата. То, что сигнал С атома изолейцина имел форму дублета, указывало на включение изотопа ¹³С в ядро данного атома и на его взаимодействие только с одним атомом ¹³С, а именно, со связанным с ним атомом углерода карбоксильной группы. Характер расщепления сигналов C и C¹ атомов изолейцина свидетельствовал о включении изотопа ¹³С в ядра данных атомов и указывал на взаимодействие между ними. Таким образом, анализ спектра подтвердил селективность мечения изолейцина изотопом ¹³С.

Характер расщепления сигналов C, С и C атомов треонина подтверждал включение изотопа ¹³С во все атомы углерода треонина (Рис. 9). То, что сигнал С атома треонина имел форму дублета дублетов, указывало на неэквивалентность связанных с ним С атома углерода и атома углерода карбоксильной группы. То, что С атом треонина давал в спектре триплет, а не дублет дублетов, свидетельствовало об эквивалентности связанных с ним C и C атомов углерода.

Сигнал С атома пропионата в ¹H-¹³C-COSY спектре имел форму дублета, что указывало на включение изотопа ¹³С в ядро данного атома и на его взаимодействие со связанным с ним С атомом углерода (Рис. 10). То, что С атом пропионата давал в спектре дублет дублетов, свидетельствовало о неэквивалентности связанных с ним С атома углерода и атома углерода карбоксильной группы. Таким образом, характер расщепления сигналов C и C атомов пропионата указывал на включение изотопа ¹³С во все атомы углерода пропионата. Это означает, что пропионат был продуктом аэробной деградации однородно меченного треонина, а не изолейцина, селективно меченного изотопом ¹³C.

Характер включения углерода ¹³С в молекулу 2-аминобутирата свидетельствовал о том, что 2-аминобутират также являлся продуктом деградации L-¹³C-треонина (Рис. 10).

Рис. 10. Срезы ¹H-¹³C-COSY спектра по оси ₁ для кросс-пиков пропионата и аминобутирата (-AВ).

Таким образом, на данном этапе работы мы показали, что в аэробных условиях в клетках E. coli может происходить деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират, и первым этапом этого пути является превращение треонина в 2-кетобутират, которое осуществляет биосинтетическая треониндезаминаза.

Изучение ферментов аэробного пути метаболизма треонина в пропионат

На втором этапе работы мы попытались идентифицировать ферменты, которые отвечают за дальнейшее превращение 2-кетобутирата в пропионат. Из литературных источников известно, что в анаэробно растущих клетках E. coli 2-кетобутират декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА пируватформиатлиазой (PflB) и формиатлиазой кетокислот (TdcE), которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. Мы предположили, что в аэробном метаболизме 2-кетобутирата в пропионат в E. coli принимают участие пируватоксидаза и пируватдегидрогеназный комплекс, так как известно, что 2-кетобутират может служить их альтернативным субстратом in vitro [Chang et al., 2000, Bisswanger et al., 1981].

Влияние амплификации и инактивации гена poxB на синтез пропионата в штамме ITP290-3

Для проверки предположения о том, что пируватоксидаза может принимать участие в деградации 2-кетобутирата, мы изучили влияние амплификации гена poxB на уровень накопления пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. С этой целью данный штамм трансформировали плазмидой pBR322-poxB, несущей ген poxB под собственной регуляцией. Как следует из Таблицы 5, амплификация гена poxB привела к снижению уровня накопления изолейцина (в 2 раза), а также значительно увеличила уровень накопления пропионата (в 3 раза) и препятствовала накоплению 2-кетобутирата. Таким образом, амплификация пируватоксидазы усилила деградацию 2-кетобутирата в пропионат.

Таблица 5. Влияние амплификации гена poxB на уровень накопления изолейцина, пропионата и 2-кетобутирата в штамме ITP290-3