Автореферат: Изучение элементов скрытого метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Изучение элементов “скрытого” метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

03.00.03 - Молекулярная биология

Сычева Елена Викторовна

Москва, 2008 г.

Работа выполнена в лаборатории №3 Научно-исследовательского института «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.В. Стойнова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.С. Миронов ФГУП “ГосНИИгенетика”

кандидат биологических наук С.В. Беневоленский Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Ведущая организация: Институт общей генетики им Н.И. Вавилова РАН

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути “скрытого” метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [D'Ari & Casadesus, 1998]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование “ненужных” путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться “скрытые” метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей.

Мы столкнулись с явлением “скрытого” метаболизма при конструировании на основе E. coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина - биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AHAS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата - предшественника изолейцина.

При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина.

К настоящему времени в клетках E. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина - превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-3-кетобутират-КоА-лигаза (Kbl) [Aronson et al., 1989], и анаэробная деградация до пропионата [Helinger et al., 1998] (Рис. 1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы - TdcD и AckА. Другие пути деградации треонина в клетках E. coli к настоящему времени не охарактеризованы.

Рис. 1. Метаболизм L-треонина в E. coli

Tdh - треониндегидрогеназа, Kbl - 2-амино-3-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA - треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS - синтазы ацетогидроксикислот; TdcB - треониндезаминаза (катаболитная), PflB - пируватформиатлиаза, TdcE - 2-кетобутиратформиатлиаза, Pta - фосфотрансацетилаза, AckА, TdcD - пропионаткиназы.

аэробный метаболизм треонин кетобутират

Цели и задачи работы. Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО “АГРИ” и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках E. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата.

В процессе работы решались следующие задачи:

- изучение путей аэробной деградации треонина в клетках E. coli;

- идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в E. coli;

- создание коллекции экспрессионных кассет, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из E. coli и Мethylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот;

- исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата;

- изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в клетках E. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе изучена аэробнaя деградация L-треонина, однородно меченного изотопами ¹⁴С и ¹³C, в модельном штамме E. coli ITP290-3. Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR, кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Показано, что в клетках E. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот E. coli и M. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN E. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Получен штамм E. coli с делециями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках E. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология”, посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, ноябрь-декабрь 2006 г.) и на смотрах-конкурсах работ сотрудников ЗАО “АГРИ” (Москва, июнь 2004 г., июнь 2007 г.).

Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре ЗАО “АГРИ” и Секции Учёного Совета ФГУП “ГосНИИГенетика” 30 октября 2007 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано семь печатных работ, из них две в отечественном журнале, четыре тезисных сообщения в материалах научной конференции и одна патентная заявка.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ___ листах машинописного текста, включая ___ рисунков и ___ таблиц. Работа состоит из введения, списка используемых сокращений, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит ___ источников, в том числе ___ на русском языке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение деградации треонина в модельном штамме ITP290-3 в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию

Конструирование модельного штамма ITP290-3 и изучение конверсии треонина в изолейцин в условиях контролируемой экспрессии гена ilvA^IleR

Для изучения возможных путей деградации треонина нами был сконструирован модельный штамм ITP290-3. В качестве родительского штамма был использован треониновый продуцент TDH7KmS/pРRT614, который содержал на плазмиде pРRT614 структурные гены треонинового оперона thrA442BC под контролем P_R промотора фага , а также ген температурочувствительного репрессора фага - cI857, и имел хромосомную мутацию в гене tdh, предотвращающую деградацию треонина по пути дегидрирования.

Для создания условий регулируемой экспрессии треониндезаминазы в штамм TDH7KmS/pРRT614 была интегрирована экспрессионная кассета mini-Mu::P_lac-lacI-ilvA^IleR, которая содержала под контролем Plac промотора ген лактозного репрессора (lacI) и ген ilvA^IleR, кодирующий биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию. Это позволяло путем изменения концентрации индуктора лактозного оперона изопропилтиогалактозида (IPTG) плавно регулировать или полностью блокировать активность треониндезаминазы в ходе культивирования клеток. Для интеграции данной кассеты использовалась плазмида pMDv4ilvA (Рис. 2) (любезно предоставлена к.б.н. Бирюковой И.В., ЗАО “АГРИ”).

Рис. 2. Структура плазмиды pMDv4ilvA

Измерение удельной активности треониндезаминазы в клетках штамма HB101, несущего плазмиду pMDv4ilvA, подтвердило, что в условиях репрессии гена ilvA^IleR активность треониндезаминазы была достаточно низкой (на уровне штамма HB101). При добавлении индуктора активность фермента значительно увеличивалась (более чем на три порядка) и не ингибировалась изолейцином (Табл. 1).

Таблица 1. Удельная активность треониндезаминазы (ТД) в клетках штаммов HB101 и HB101/pMDv4ilvA

Удельную активность ТД измеряли в грубых экстрактах клеток, выращенных в условиях индукции IPTG (1мМ) и без индукции. Так как штамм HB101 содержит ген ilvA дикого типа, кодирующий ТД, чувствительную к изолейцину, а плазмида pMDv4ilvA содержит ген ilvA^IleR, кодирующий ТД, устойчивую к изолейцину, измерение проводили как в отсутствие, так и в присутствии изолейцина (2мМ) в пробах; НО - не определяли.

Клетки штамма ITP290-3 в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR накапливали в культуральной жидкости только треонин, а в условиях экспрессии гена ilvA^IleR - изолейцин, 2-аминобутират и не накапливали треонин (Табл. 2, опыт 1). Таким образом, штамм ITP290-3 являлся удобной моделью для изучения путей деградации треонина в условиях экспрессии биосинтетической треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию.

Анализ накопления изолейцина клетками штамма ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR показал отсутствие полного превращения треонина в изолейцин, причем деградация треонина была существенной (Табл. 2, опыт 1). Можно было бы предположить, что подобный результат связан не с деградацией треонина, а со снижением его синтеза в условиях сверхэкспрессии гена ilvA^IleR. Для проверки этого предположения мы индуцировали экспрессию гена ilvA^IleR уже после того как в клетке синтезировалось значительное количество треонина (Табл. 2, опыт 2), но и в этом случае не наблюдали полной конверсии накопленного треонина в изолейцин. Сходные результаты были получены и в случае добавления в среду экзогенного треонина (Табл. 2, опыт 3).

Таким образом, анализ продуктов, накапливаемых штаммом ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR, показал отсутствие полной конверсии как вновь синтезируемого, так и экзогенного треонина в изолейцин. Мы предположили, что неполное превращение треонина в изолейцин связано с деградацией 2-кетобутирата, который образуется из треонина под действием биосинтетической треониндезаминазы, в путях, отличных от биосинтеза изолейцина.

Для проверки этого предположения мы определили некоторые продукты, которые штамм ITP290-3 накапливает в отсутствие экспрессии гена ilvA^IleR и в условиях экспрессии гена ilvA^IleR при добавлении экзогенного треонина, т.е. в условиях избытка 2-кетобутирата (Табл. 3).

Таблица 2. Продукты ферментации, накапливаемые штаммом ITP290-3 в условиях регулируемой экспрессии треониндезаминазы