Автореферат: Изучение элементов скрытого метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот

Далее мы изучили влияние инактивации гена poxB на синтез пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Для этого хромосомную делецию гена poxB переносили в штамм ITP290-3. Видно, что инактивация гена poxB не оказала заметного влияния на уровень накопления пропионата и изолейцина в штамме ITP290-3 (Табл. 6).

Следовательно, несмотря на то, что амплификация пируватоксидазы усиливает деградацию 2-кетобутирата в пропионат, очевидно, что этот путь деградации 2-кетобутирата не является единственным и ключевым.

Таблица 6. Влияние инактивации гена poxB на уровень накопления пропионата и изолейцина в штамме ITP290-3

*Среда содержала глюкозу (4%), треонин (5.7 г/л), IPTG (1мМ).

Влияние инактивации гена aceE на синтез пропионата в штамме ITP290-3

Для проверки предположения о том, что пируватдегидрогеназный комплекс (PDHC) может принимать участие в деградации 2-кетобутирата, мы изучили влияние инактивации гена aceE, кодирующего E1p субъединицу PDHC, на уровень синтеза пропионата в штамме ITP290-3 в условиях экспрессии гена ilvA^IleR. Для этого в штамм ITP290-3 трансдукцией фагом P1 вводили хромосомную делецию гена aceE. Полученный в результате штамм ITP290-3aceE для роста на минимальной среде нуждался в добавлении ацетата.

Как следует из Таблицы 7, штамм ITP290-3aceE в условиях экспрессии гена ilvA^IleR не накапливал пропионат и ацетат, а уровень накопления 2-кетобутирата увеличился на 30% по сравнению с исходным штаммом. Это означает, что инактивация E1p субъединицы пируватдегидрогеназного комплекса блокировала превращение 2-кетобутирата в пропионат.

Таблица 7. Влияние инактивации гена aceE на накопление пропионата в штамме ITP290-3

* Культивирование проводили в пробирках со средой, содержащей глюкозу (4%), с добавками треонина (5.7 г/л), IPTG (1мМ) и (если указано) ацетата натрия (0.4%).

Таким образом, полученные данные позволяют нам сделать вывод о том, что основную роль в аэробной деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Очевидно, что он осуществляет превращение 2-кетобутирата в пропионил-КоА, который, по-видимому, метаболизируется в пропионат фосфотрансацетилазой (Pta) и пропионаткиназой (AckA) (Рис. 11).

Пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, однако в отсутствие сверхэкспрессии ее вклад в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Деградацию 2-кетобутирата в пропионат можно считать примером “скрытого метаболизма”, который обусловлен повышением уровня 2-кетобутирата в клетке в результате сверхэкспрессии гена ilvA^IleR, что приводит к его утилизации пируватдегидрогеназным комплексом.

Рис. 11. Возможные пути метаболизма 2-кетобутирата в клетках E. coli

PDHC - пируватдегидрогеназный комплекс, PflB, TdcE - пируватформиатлиазы, AHAS I, III - синтазы ацетогидроксикислот I и III, IlvE - трансаминаза В, AvtA - трансаминаза С, PoxB - пируватоксидаза, Acs - ацетил-КоА-синтаза, PrpC - метилцитратсинтаза, PrpD - 2-метилцитратдегидратаза, AcnB - аконитаза В, PrpB - 2-метилизоцитратлиаза, ОА - оксалоацетат. Реакции метилцитратного цикла обозначены пунктирными стрелками

Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле

Известно, что у E. coli и S. typhimurium существует еще одна ферментная система, способная осуществлять метаболизм пропионил-КоА - метилцитратный цикл, в котором пропионил-КоА окисляется до пирувата (Рис. 11) [Textor et al., 1997, London et al., 1999, Brock et al., 2002]. Однако у E. coli данный цикл функционирует только после длительной адаптации клеток к росту на пропионате, поэтому клетки E. coli дикого типа не используют пропионат в качестве источника углерода [Horswill et al., 1999].

Для того чтобы выяснить, может ли в клетках штамма ITP290-3 происходить утилизация пропионил-КоА в пируват ферментами метилцитратного цикла одновременно с его превращением в пропионат под действием Pta и AckA, мы проанализировали рост этого штамма на пропионате как единственном источнике углерода. Однако нам не удалось отобрать клоны, растущие на пропионате.

Полученный результат находится в хорошем соответствии с данными по анализу распределения изотопа ¹³С в продуктах деградации L-¹³С-треонина в штамме ITP290-3, согласно которым ¹³C-атомы отсутствовали как в пирувате (Табл. 3), так и в C и C2 атомах изолейцина (Рис. 9). Следовательно, метилцитратный цикл, преобразующий пропионил-КоА в легко утилизируемый пируват, по-видимому, не активен в условиях проведенного эксперимента.

Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот

В первой части нашей работы было показано, что в клетках E. coli может происходить деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират, если отсутствует эффективная утилизация 2-кетобутирата синтазами ацетогидроксикислот (AHAS). Поэтому при создании промышленно значимого продуцента изолейцина для предотвращения возможной деградации 2-кетобутирата необходимо было согласовать экспрессию ключевых ферментов биосинтеза изолейцина - биосинтетической треониндезаминазы и синтаз ацетогидроксикислот. С этой целью нами был получен набор экспрессионных кассет, содержащих гены AHAS из E. coli и M. methylotrophus (Табл. 8).

Таблица 8. Сконструированные экспреcсионные единицы, содержащие гены синтаз ацетогидроксикислот из E. coli и M. methylotrophus

В E. coli охарактеризованы три изофермента синтаз ацетогидроксикислот (AHAS I - продукт генов ilvBN, AHAS II - продукт генов ilvGM, и AHAS III - продукт генов ilvIH), которые отличаются по ферментативным свойствам - субстратной специфичности и ингибированию валином. Известно, что в клетках E. coli дикого типа функционируют только два изофермента - AHAS I и AHAS III, которые подвержены ингибированию валином. Для экспрессии устойчивой к валину AHAS II, которая обладает наибольшим сродством к 2-кетобутирату, необходимо наличие мутации в гене ilvG, восстанавливающей трансляционную рамку этого гена [Lawther et al., 1982].

Для удобства клонирования генов AHAS на основе штамма E. coli K-12 ВКПМ-7 (или В7) нами были получены штаммы B7?ilvIH - с делецией ilvIH оперона, B7?ilvBN?ilvIH - с делецией ilvBN и ilvIH оперонов, и B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH - с делециями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот.

Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона

В нашей лаборатории ранее был получен штамм-продуцент изолейцина 44-3-15, который содержит в хромосоме несколько копий кассеты mini-Mu::PR-ilvG^ValR71MEDA7434, обеспечивающей эффективную экспрессию ферментов, необходимых для биосинтеза изолейцина и валина. Определение удельной ацетолактатсинтазной (АЛС) активности в штамме 44-3-15ilvBNilvIH с делециями генов, кодирующих AHAS I и AHAS III, на разных этапах культивирования показало, что суммарная и особенно валин-устойчивая АЛС активность значительно снижалась на поздней логарифмической стадии роста. Мы предположили, что это связано главным образом с низкой стабильностью AHAS II.

Для проверки данного предположения мы определили время полужизни AHAS II для штамма 44-3-15, которое оказалось очень низким и составило 50 минут, тогда как время жизни треониндезаминазы составило 105 минут. Такое различие в стабильности этих ключевых ферментов биосинтеза изолейцина может привести к активации альтернативных путей утилизации 2-кетобутирата в ранней стационарной фазе роста клеток и накоплению продуктов его деградации.

С целью увеличения экспрессии AHAS II в стационарной фазе роста клеток оперон ilvG603M был клонирован в составе интегративного вектора pMIV-5JS под контролем регуляторной области ilvBN оперона, поскольку по данным DNA-array анализа, выполненного для штамма-продуцента изолейцина, уровень транскрипции этого оперона увеличивается в стационарной фазе роста (к.б.н. Птицын Л.Р., ЗАО “АГРИ”). Полученная в результате плазмида pMIV-PivbL-ilvGM была использована для введения кассеты mini-Mu::attR-cat-attL-PivbL-ilvG603M в хромосому штамма 44-3-15, что привело к увеличению уровня удельной валин-устойчивой активности ацетолактатсинтазы в стационарной фазе роста на 60%. Однако возможности дальнейшего увеличения активности AHAS II в клетках ограничены, так как было показано, что фермент в высоких концентрациях способен агрегировать. В связи с этим, для увеличения активности AHAS нам представлялось целесообразным амплифицировать AHAS I и AHAS III.

Клонирование генов AHAS I в составе оперона PthrA-att-thrA442B

Для того чтобы можно было усилить в клетке одновременно и синтез треонина, и утилизацию 2-кетобутирата, гены AHAS I были клонированы в составе интегративной плазмиды pMT17, несущей гены синтеза треонина thrA442BC под контролем промотора треонинового оперона с удаленным аттенуатором, фланкированные attL- и attR-сайтами фага Mu. В ходе конструирования фрагмент гена thrC плазмиды был заменен фрагментом ДНК, содержащим структурные гены ilvBN оперона. Полученная в результате экспрессионная кассета mini-Mu::PthrA-att-thrA442B-ilvBN была интегрирована в хромосому штамма B7ilvBNilvIH.

Оказалось, что уровень удельной ацетолактатсинтазной активности в клетках штамма B7ilvBNilvIH att-thrA442B-ilvBN, содержащего в хромосоме кассету mini-Mu::PthrA-att-thrA442B-ilvBN, был в четыре раза выше, чем в клетках штамма B7ilvIH, содержащего в хромосоме ilvBN оперон под собственной регуляцией (Табл. 9). Таким образом, нами была получена кассета, которая обеспечивала эффективную экспрессию ilvBN генов с промотора треонинового оперона совместно с генами thrA442B.

Таблица 9. Результаты измерения удельной АЛС активности в штаммах E. coli

Клонирование генов AHAS из M. methylotrophus

Известно, что клетки M. methylotrophus устойчивы к валину. Кроме того, в геноме этих бактерий обнаружена только одна открытая рамка считывания, гомологичная большой субъединице AHAS III E. coli. Поэтому с целью поиска гомологов устойчивых к валину AHAS из других организмов оперон ilvIH, кодирующий синтазу ацетогидроксикислот M. methylotrophus, был клонирован в составе интегративных векторов pMIV-5JS (под собственной регуляцией) и pM17 (под контролем PR промотора фага ). Полученные в результате плазмиды pMIV5JS-ilvIH^Mme и pM17-PR-ilvIH^Mme обеспечивали рост штамма B7?ilvBN?ilvGM?ilvIH на минимальной среде в присутствии 1 г/л валина. Таким образом, мы показали, что экспрессия генов AHAS из M. methylotrophus в E. coli может осуществляться не только с PR промотора, но и с нативного промотора.