Индивиды с большим количеством АкРГ (более 22 усл.ед.) также не представлены в выборке СВ. Мы объясняем это двумя причинами. Как показали данные модельного исследования действия K2CrO4 на культивируемые фибробласты, клетки с большим количеством АкРГ повышенно устойчивы к апоптозу, индуцируемому генотоксическим агентом. Благодаря более высокой активности синтеза белка (большего количества рРНК, а значит и рибосом) клетки с поврежденной ДНК могут выжить и не подвергнуться апоптозу. Но при этом возрастет вероятность мутаций в ДНК, что может привести к возникновению опухоли или других заболеваний, сокращающих продолжительность жизни.
Вторая возможная причина - это наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение количества АкРГ и не высокая продолжительность жизни. Из литературы известно пока только одно заболевание (исключая синдром Дауна с трисомией по 21 хромосоме), при котором было обнаружено для части больных значительное увеличение количества АкРГ в геноме - это шизофрения (Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003) (рис. 14). Авторами этих работ высказано предположение, что увеличение активности РГ связано с наличием врожденной генетической патологии, для компенсации которой необходим интенсивный синтез белка и, следовательно, большое количество АкРГ в геноме.
Общее число копий РГ зависит от количества АкРГ в геноме и от количества метилированных КМРГ. Результаты, полученные в нашем исследовании, позволяют сделать вывод, что при старении геном, с большой вероятностью, теряет высокометилированные КМРГ. Эти данные могут отчасти объяснить противоречивость полученных ранее разными авторами результатов об изменении количества и метилирования РГ при старении клеток и тканей животных. В зависимости от наличия или отсутствия КМРГ в геноме исследуемых клеток можно обнаружить или не обнаружить статистически значимое снижение содержания РГ в геноме. КМРГ не транскрибируются, являясь своеобразным «балластом» генома. Потеря этих последовательностей при старении не должна сказываться на количестве синтезируемой РНК- полимеразой 1 рРНК. Также важен обнаруженный нами факт, что в состарившихся клетках, имеет место повреждение цепи рДНК в значительном числе копий рДНК. Эти нарушения могут приводить как к блокированию клеточного цикла, так и к низкой устойчивости к стрессу. Оба этих события сопутствуют старению и смерти организма.
Наши данные показали, что распределение по числу копий РГ в геноме для людей старше 80 лет значительно сужено по сравнению с выборкой здоровых людей среднего возраста (см. рис. 15). По-видимому, значительное уменьшение доли высокопийных по рДНК геномов в группе СВ происходит вследствие трех причин: (1) потеря в течение жизни КМРГ, которые встречаются только в геномах с большим числом копий (Вейко Н.Н., 2001), (2) снижение числа людей с большим количеством АкРГ, которым соответствуют большое число копий РГ и (3) наличие в популяции генетической патологии, для которой характерно увеличение общего числа копий РГ и не высокая продолжительность жизни. Увеличение общего числа копий РГ, также как и количества АкРГ, ранее наблюдали для геномов больных шизофренией (см. рис. 15). Небольшое уменьшение доли низкокопийных по рДНК геномов в выборке СВ связано, по-видимому, с уменьшением в выборке СВ людей с низкими количествами АкРГ, геномы которых содержат мало КМРГ.
Рис. 15. Сравнение распределений по числу копий РГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ((Вейко Н.Н., Шубаева Н.О. и соавтр., 2006), темно-серый цвет) и больных шизофренией ((Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003), черный цвет).
Исследование репликативного старения показало, что длительность пролиферативного периода культур с количеством АкРГ в геномах от 16,7 до 21,5 усл.ед. не зависит от свойств комплекса РГ и диктуется определенным состоянием клетки к началу культивирования вне организма. Это состояние может быть охарактеризовано не зависящими от свойств комплекса РГ, но коррелирующими между собой параметрами - содержанием теломерного повтора в геноме, показателями спонтанного апоптоза клеток (активность каспазы 3 и количество вкДНК). Штаммы с максимальными содержаниями ТП в геноме имеют минимальные показатели уровня апоптоза на раннем пассаже и переживают максимальное число пассажей. Однако интенсивность ответа клеток ранних пассажей на экзогенное повреждающее воздействие напрямую зависит от количества АкРГ: чем больше АкРГ в геноме, тем меньше относительное увеличение активности каспазы 3 и количества вкДНК в культуре.
При изучении репликативного старения и ответа клеток на окислительный стресс обнаружен новый факт, имеющий принципиальное значение для развития дальнейших исследований роли РГ в процессах старения. Оказалось, что от количества АкРГ в геноме фибробластов напрямую зависит эндонуклеазная активность клеток, которую мы тестировали в клеточных лизатах. Положительную корреляцию между НА и количеством АкРГ в геноме мы обнаружили в интактной субконфлуентной культуре клеток, при действии на клетки малых доз хромата калия и при индукции апоптоза клеток. Повышенную НА в клетках с большим количеством АкРГ нельзя объяснить увеличением общего уровня синтеза белка в клетках с более активным синтезом рРНК. При действии малых доз хромата калия в одном из штаммов с большим количеством АкРГ наблюдалось снижение количества клеточной РНК, но уровень НА оставался высоким. Для клеток с большим количеством АкРГ и соответственно более высоким уровнем НА, мы наблюдали, как правило, значительно более сильную фрагментацию внеклеточной ДНК.
В работе мы высказали предположение, что повышенная НА клеток с большим количеством АкРГ в геноме - это возможная компенсаторная реакция клетки на более высокие концентрации CpG-богатых фрагментов РГ в внеклеточной среде, которые могут нанести вред, индуцируя дополнительный окислительный стресс путем взаимодействия с рецепторами TLR9. Очевидно, для окончательного вывода о роли высоких значений НА в функционировании клеток с большим количеством АкРГ требуются дальнейшие исследования.
Выводы
1. В выборке людей старческого возраста по сравнению с людьми среднего возраста значительно сужены интервалы варьирования общего числа копий РГ в геноме и количества активных копий РГ.
2. У людей старческого возраста снижено содержание в геноме высокометилированных кластеров молчащих рибосомных генов. При репликативном старении геном человека теряет высокометилированные кластеры неактивных копий РГ.
3. При репликативном старении культивируемых фибробластов кожи человека происходит значительное повреждение первичной структуры рДНК, что проявляется в значительном занижении показателей real-time ПЦР.
4. Скорость репликативного старения фибробластов кожи и маркеры старения не зависят от геномной дозы РГ и от возраста доноров кожи.
5. При действии хромата калия, индуцирующего дополнительный окислительный стресс, относительные изменения в уровне апоптоза клеток отрицательно коррелируют с количеством активных копий РГ в геноме клетки: минимальные изменения в уровне апоптоза демонстрируют штаммы с большим количеством РГ.
6. Уровень эндонуклеазной активности фибробластов (и степень фрагментации внеклеточной ДНК) при нормальном культивировании и в условиях окислительного стресса положительно коррелирует с количеством активных копий РГ в геноме штамма.
Список используемых сокращений
АкРГ - активные копии рибосомных генов;
вкДНК - внеклеточная ДНК;
ГС - группа сравнения;
КМРГ - кластеры «молчащих» (т.е. неактивных) генов;
МЧП - максимальное число пассажей;
НА - нуклеазная активность;
РА - ревматоидный артрит;
РГ - рибосомные гены;
РП - рибосомный повтор;
СВ - люди старческого возраста;
ТП - теломерный повтор;
MyD88 -миелоидный фактор дифференцировки;
TLR - «Toll-like»-рецепторы.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Малиновская Е.М. Изменения комплекса рибосомных генов человека при старении./ Малиновская Е.М., Смирнова Т.Д., Еголина Н.А., Цветкова Т.Г., Косякова Н.В., Мандрон И.А., Мхитарова Е.В., Костюк С.В., Терехов С.М., Местергази Г.М., Вейко Н.Н., Ляпунова Н.А. // Медицинская генетика. - 2008. - Т.7, №2., С.10-16.
2. Ермаков А.В. Фрагменты ДНК, обнаруживаемые в среде после воздействия ионизирующей радиации в адаптирующих дозах, являются фактором стресс-сигнализации между лимфоцитами и клетками-свидетелями. / Ермаков А.В., Костюк С.В., Еголина Н.А., Малиновская Е.М., Вейко Н.Н., Спитковский Д.М. // Рад.биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47, №2. - С.133-140.
3. Ермаков А.В. Сигнализация между лимфоцитами человека после индукции эффекта свидетеля ионизирующей радиацией в адаптирующих дозах. / Ермаков А.В., Костюк С.В., Еголина Н.А., Калашникова Е.А., Кокаровцева С.Н., Малиновская Е.М., Вейко Н.Н. // Рад.биология. Радиоэкология. - 2007. - Т.47, №6, С.650-657.
4. Ermakov A.V. Factors of stress signaling X-irradiatid and noniradiated human lymphocytes. / Ermakov A.V., Kostyuk S.V., Konkova M.S., Egolina N.A., Malinovskaya E.M., Veiko N.N. // Ann N Y Acad Sci. - 2008 -V.1137. - P.41-46.
5. Малиновская Е.М. Количественные характеристики комплекса рибосомных генов у индивидов старческого возраста. / Малиновская Е.М. // Материалы 70-й юбилейной итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». I часть. - Уфа. 2005. - С.15-16.
6. Вейко Н.Н. Фрагменты внеклеточной ДНК - факторы клеточной стресс-сигнализации при действии ионизирующей радиации. / Вейко Н.Н., Ермаков А.В., Костюк С.В., Малиновская Е.М., Еголина Н.А., Замулаева И.А., Саенко А.С. // Тез. Докл. Международной конференции “Новые направления в радиобиологии” - Москва, 2007. - С.10-13.
7. Konkova M.S. The cell-free DNA fragments are factors of stress-signaling from irradiated to non-irradiated human lymphocytes after exposure by low doses of the X-radiation. / Konkova M.S., Ermakov A.V., Kostyuk S.V., Egolina N.A., Malinovskaya E.M., Veiko N.N. // CNAPS-V (“Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum”): Abstracts. - Moscow, 2007. - P.16.
8. Egolina N.A. Human ageing is not accompanied by decreasing of genomic dosage of ribosomal genes. Тез. 6-го европейского конгресса «Healthy and active ageing for all Europeans». / Egolina N.A., Lyapunova N.A., Veiko N.N., Mkhitarova E.V., Tsvetkova T.G., Mandron I.A., Kosyakova N.V., Malinovskaya E.M., Agapova R.K., Porokhovnik L.N., Mestergazi G.M. // Успехи геронтологии. - 2007. - Т.20, №3. - С.30.
9. Малиновская Е.М. Изменения комплекса рибосомных генов при репликативном старении фибробластов кожи человека. / Малиновская Е.М., Вейко Н.Н. // Тезисы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. 2008. - С.261-262.