Автореферат: Изменения комплекса рибосомных генов человека в процессе естественного и репликативного старения

Рис. 1. Частотное распределения общего числа копий РГ (а) и относительного количества АкРГ (б) в геномах людей СВ и ГС.

Таблица 1. Общее число копий и относительное количество АкРГ в геномах ГС и СВ

Средние значения АкРГ в лимфоцитах людей СВ и ГС не различаются, при этом, как и в случае общего числа копий, наблюдается уменьшение интервала варьирования и величины дисперсии для СВ в сравнении с ГС.

Оценка количества метилированных копий РГ в геномах людей старческого и среднего возраста. На наличие в геноме кластеров «молчащих» рибосомных генов (КМРГ) указывает величина отношения общего числа копий РГ (К) к числу активных копий РГ (А), К/А> 26±1 (Вейко Н.Н., 2001). КМРГ не транскрибируются и, как правило, высокометилированы. На рис. 2а приведены распределения величины К/А в геномах группы СВ и ГС. В отличие от ГС, в группе СВ редко встречаются индивиды, у которых в геноме есть небольшие КМРГ.

Поскольку КМРГ высокометилированы, их отсутствие в геноме должно коррелировать со сниженным уровнем метилирования РГ. Мы провели сравнительный анализ метилирования РГ в геномах ГС и СВ. Для этого определили показатель М, равный отношению гибридизационных сигналов НрaII- и Msp1- гидролизатов геномной ДНК (Вейко Н.Н., Ляпунова Н.А. и соавтр., 2008), полученных при гибридизации с зондом на рДНК. Последовательность РГ содержит много сайтов Msp1НрaII. Фрагменты, получающиеся при гидролизе неметилированных копий РГ, имеют малую длину, что препятствует их эффективной иммобилизации на нитроцеллюлозной мембране. Чем больше метилированных копий РГ в геноме, тем выше показатель М.

Мы выделили три группы, различающиеся по показателю М. Для доноров группы 1М значения М варьируют от 1,1 до 1,7 , для группы 2М показатель метилирования изменяется от 1,7 до 2,5 и для группы 3М - от 2,5 до 3, 1. Более 80% анализируемых образцов ДНК группы СВ были отнесены к группе 1М (мало метилированных копий РГ). Таким образом, в геномах людей СВ снижено содержание КМРГ и это коррелирует со сниженным уровнем метилирования РГ.

Возникает вопрос: теряются ли КМРГ при старении организма или до старости доживают преимущественно те индивиды, у которых в геноме изначально нет копий КМРГ? В последнем случае отсутствие КМРГ в геноме можно было бы рассматривать как прогностический маркер долголетия.

Поскольку мы не располагаем возможностью проследить изменение количества КМРГ в геноме на протяжении всей жизни одних и тех же индивидов, для ответа на поставленный вопрос мы обратились к модельной системе - репликативному старению культивируемых фибробластов кожи человека, которое многими авторами рассматривается как адекватная модель изучения механизмов старения млекопитающих.

Анализ влияния свойств комплекса РГ на скорость репликативного старения фибробластов кожи человека. Для отбора доноров кожи применили два критерия - возраст донора и количество АкРГ в геноме, определенных ранее в культивируемых лимфоцитах. Основные характеристики штаммов приведены в таблице 2.

Таблица 2. Характеристики анализируемых в работе штаммов фибробластов

*) характеристики определены для субконфлуентных клеток на 5-м пассаже

Свойства комплекса РГ. Число копий РГ в геномах клеток 5-го пассажа варьировало от 370 до 670, относительное количество АкРГ - от 16,7 до 21,5 усл.ед. Для клеток штаммов 2206 и 2207 значения показателя К/А оказались выше порогового значения 26, что позволяет предположить присутствие в геноме КМРГ. Для остальных штаммов величины К/А находились в интервале значений, характерных для геномов, в которых КМРГ отсутствуют. Для трех штаммов с разными значениями отношения К/А (2206, 2207 и 2208) был определен показатель метилирования. Сравнение значений К/А и М выявило высокую положительную корреляцию между этими параметрами (k = 0,997; р = 0,05; N = 3), что подтверждает предположение о наличии в геномах штаммов 2207 и 2206 высокометилированных кластеров РГ, которые составляют соответственно примерно 33 % и 26 % всех копий РГ. Количество РНК, определенное в расчете на 1 мкг клеточной ДНК (табл.2, строка 9), отражает, прежде всего, количество рРНК, т.к. рРНК составляет от 80 до 90% клеточной РНК. Мы наблюдали положительную зависимость количества РНК от количества АкРГ в геноме клеток (рис. 3).

Маркеры репликативного старения:

(1) Максимальное число пассажей (МЧП). Скорость репликативного старения характеризуется величиной МЧП клеток культуры (строка 2, табл. 2). Показатель МЧП изменялся от 47 (штамм 2212) до 66 (штамм 2207). Для определения МЧП необходимы длительные эксперименты по культивированию клеток. Мы определили, что можно прогнозировать скорость старения, определяя некоторые параметры культуры, коррелирующие с МЧП, задолго до того, как клетки перестанут делиться.

(2) Число клеток на фиксированной площади на 40-м пассаже (строка 4) коррелирует с МЧП (показатели линейной регрессии, k = 0,99; p < 0,01; n = 5) и также отражает старение культуры - «старые», неделящиеся клетки занимают большую площадь, чем «молодые» и пролиферирующие.

(3) Содержание теломерного повтора в клетках 5-го пассажа. В последние годы получены доказательства того, что уменьшение содержания в геноме ТП - это следствие (маркер), но не причина старения (Оловников А.М., 2003). Содержание ТП в геномах клеток 5-го пассажа (строка 5, табл.2) коррелирует с МЧП (k = 0,99; p < 0,01; n = 5) и может рассматриваться как прогностический маркер старения. Содержание ТП на 5-м пассаже и число клеток на 40-м пассаже также связаны линейной зависимостью (k = 0,97; p = 0,005; n = 5).

Уровень спонтанного апоптоза в клетках 5-го пассажа оценивали по двум показателям: активность в клеточных лизатах одного из ключевых ферментов апоптоза - каспазы 3 (табл. 2, строка 13) и количество внеклеточной ДНК (вкДНК) по отношению к общему количеству ДНК в лунке планшета (строка 11). Значения этих маркеров апоптоза (рис. 4) отрицательно коррелируют с МЧП (и с содержанием ТП).

Рис. 4. Зависимость активности каспазы 3 (а) и количества вкДНК (б) в культуре клеток 5-го пассажа от МЧП.

Таким образом, культуры клеток с относительно низкой скоростью репликативного старения на ранних пассажах характеризуются высоким содержанием в геноме ТП и низким уровнем спонтанного апоптоза

Сопоставление свойств комплекса РГ и маркеров старения. Методом линейной регрессии мы проанализировали зависимость свойств комплекса РГ клеток 5-го пассажа (число копий, количество АкРГ, показатели К/А и М) от маркеров старения (МЧП, содержание ТП, спонтанный апоптоз). Характеристики комплекса РГ клеток практически не влияли на скорость пролиферативного старения. К моменту начала культивирования вне организма клетки находятся в определенном состоянии, которое характеризуется уровнем спонтанного апоптоза и содержанием ТП и не зависит от свойств комплекса РГ. Это состояние определяет длительность пролиферативного периода клеток в условиях нормального культивирования при отсутствии внешних воздействий, которые могут индуцировать дополнительный окислительный стресс.

рибосомный ген репликативный старение

Изменения некоторых свойств генома при репликативном старении:

Изменение содержания контрольной последовательности (ТП). На рис. 5 показано содержание ТП в геномной ДНК, выделенной из клеток различных пассажей.

В содержании ТП в ДНК клеток 5-го пассажа наблюдается вариабельность и отрицательная зависимость между содержанием ТП и числом пассажей культуры (k = - 0,7; р < 0,0001; N = 45). Весь период культивирования клеток можно условно разбить на два отрезка: «ранние пассажи» (5-31), когда наблюдается выраженное снижение содержания ТП в ДНК при делении клеток (k= - 0,53; р = 0,01; N = 20) и «поздние пассажи», когда содержание ТП в ДНК клеток незначительно изменяется в последующих генерациях клеток (k = - 0,33; р = 0,1; N = 25). На рис. 6а приведены данные по среднему содержанию ТП в ДНК клеток «ранних» и «поздних» пассажей. Для всех штаммов выявлено достоверное снижение содержания ТП в ДНК клеток «поздних» пассажей.

Изменение содержания РГ и уровня метилирования РГ. Сравнение среднего содержания РГ в ДНК клеток «ранних» и «поздних» пассажей демонстрирует тенденцию к уменьшению общего числа копий РГ в геномах фибробластов при репликативном старении (рис. 6б). В случае штаммов 2207 и 2206, которые содержат КМРГ, уменьшение статистически значимо. Геномы этих штаммов теряют соответственно примерно 36 % и 26 % всех копий РГ. Естественно предположить, что теряются, прежде всего, метилированные КМРГ, содержание которых в геномах клеток «ранних» пассажей близко к количеству теряемых на «поздних» пассажах копий РГ.

Рис. 6. Средние значения содержания ТП (а) и РП (б) в ДНК культивируемых фибробластов «ранних» (светлые столбики) и «поздних» (темные столбики) пассажей. * - различия в содержании РГ на «ранних» и «поздних» пассажах достоверны (р < 0 ,001).

Для того чтобы подтвердить это предположение, мы сравнили показатели метилирования РГ для штаммов 2206, 2207 и 2208 на пятом и последнем пассажах (соответственно 57-, 66- и 62-ом). Результаты представлены на рис. 7. На последних пассажах штаммов 2206 и 2207 наблюдается значительное снижение показателя М, в геноме практически не остается высокометилированных копий РГ.

Приведенные данные позволяют сделать вывод: при репликативном старении фибробластов кожи человека из генома удаляются неактивные кластеры высокометилированных РГ.

Повреждение рибосомных генов при репликативном старении. Мы сочли целесообразным подтвердить данные об изменении числа копий РГ при старении фибробластов, полученные с помощью метода дот-гибридизации, методом «real-time» ПЦР (рис. 8).

Рис. 8. Относительное содержание гена 18S рРНК и гена GAPDH в ДНК фибробластов 5-го (светлые столбики) и одного из последних (темные столбики) пассажей. Цифры под столбиками - номер пассажа. * - различия в содержании анализируемых генов в ДНК достоверны (р < 0,001).

Анализ содержания фрагмента 18SрДНК длиной 269 п.н. в варианте «ТagMаn» ПЦР был проведен для ДНК штаммов 2206, 2207 и 2208, для которых мы наблюдали наибольшие изменения количества РГ при старении клеток. Для сравнения в тех же образцах ДНК анализировали содержание уникального гена GAPDH. В качестве внутреннего стандарта использовали ген Myd88. Содержание 18SрДНК в ДНК клеток «поздних» пассажей снижалось значительно сильнее, чем можно было ожидать, ориентируясь на данные количественной дот-гибридизации. Изменения в содержании гена GAPDH при старении были разнонаправленными, поэтому низкую эффективность ПЦР в случае рДНК клеток последних пассажей нельзя объяснить ингибиторами, которые могли бы содержаться в образцах ДНК клеток поздних пассажей. Трудно допустить, что на самом деле содержание РГ в геноме при старении снижается на порядок, тем более что по данным количественной дот-гибридизации потери не превышают 40 %. Низкую эффективность ПЦР в этом случае можно объяснить модификацией последовательности РГ в «старых» фибробластах. Известно, что при старении снижается эффективность ответа клеток на повреждающие воздействия. Некоторые виды повреждений в РГ репарируются с гораздо меньшей скоростью, чем аналогичные повреждения последовательностей генома, транскрибируемых РНК полимеразой II (Stevnsner T. et al., 1993). Однонитевые разрывы и модификация оснований приводят к тому, что, во-первых, снижается эффективность комплексообразования используемых в ПЦР праймеров с ДНК-мишенью, и, во-вторых, полимераза Taq1 не способна «прочитать» весь анализируемый фрагмент. Модификация последовательности РГ в клетке, по-видимому, должна сопровождаться снижением количества транскрибируемых копий РГ, поскольку повреждение ДНК является препятствием для работы РНК полимеразы 1. Таким образом, мы можем высказать предположение, что, несмотря на относительно небольшое снижение общего числа копий РГ при репликативном старении, количество неповрежденных копий, которое потенциально способно транскрибироваться, снижается в несколько раз. Это может являться одной из причин (возможно, решающей) блокирования пролиферации.