Влияние свойств комплекса РГ на функционирование культивируемых фибробластов кожи в условиях окислительного стресса, вызываемого хроматом калия. Репликативное старение, равно как и естественное старение организма, зависит от двух основных факторов - свойств генома и свойств среды культивирования (обитания). Действие неблагоприятных факторов среды может значительно ускорять старение и сокращает продолжительность пролиферативного периода культивируемых клеток. В англоязычной литературе введен специальный термин - стресс-индуцированное преждевременное старение (SIPS) (Toussaint O. et all., 2000). Стресс-индуцированное старение сопровождается значительным снижением длины теломеры уже на ранних пассажах культивируемых клеток (Toussaint O. et all., 2000). В нашей работе мы исследовали действие K2CrO4 на культивируемые фибробласты кожи здоровых людей, чтобы оценить, могут ли свойства комплекса РГ влиять на последствия действия на клетки неблагоприятных факторов среды, которые индуцируют сильный окислительный стресс и ускоряют процесс старения. Исследование влияния K2CrO4 на штаммы фибробластов 5-го пассажа, включало 2 этапа, которые были спланированы на основании проведенных ранее исследований кинетики действия K2CrO4 на фибробласты здорового донора (Вейко Н.Н., Терехов С.М. и соавтр., 2005):
1. «Ранний» ответ на стресс, который мы тестировали после действия «малых» доз K2CrO4 (4 часа культивирования в присутствии 4 и 6 мкМ K2CrO4 );
2. «Поздний» ответ, индуцированный заменой среды культивирования, после действия 4 и 6 мкМ K2CrO4 хромата в течение суток. Анализ проводили через 72 часа после смены среды.
«Ранний» ответ фибробластов на действие «малых» доз K2CrO4
Изменение количества клеточной РНК. Действие малых доз K2CrO4 вызывает увеличение количества РНК в культивируемых фибробластах 4-го пассажа здорового молодого донора (Вейко Н.Н., Терехов С.М. и соавтр., 2005). Анализ изменения количества РНК при действии малых доз хромата в клетках пяти штаммов в связи с параметрами, приведенными в таблице 2 (маркеры старения, свойства комплекса РГ, возраст), выявил только одну зависимость - от возраста донора (рис. 9). Очевидно, что в фибробластах, полученных от доноров 52 лет, наблюдается снижение количества РНК в присутствии хромата, в отличие от клеток молодых доноров, для которых количество РНК при действии K2CrO4 увеличивается на 40-70 %.
Рис. 9. Изменение количества РНК в клетках 5 (светлые столбики) и 22 (темные столбики) пассажей относительно контроля (5 и 22 пассаж без K2CrO4) при действии 4 мкМ K2CrO4 (4 часа).
Ранее было обнаружено, что эффект изменения количества РНК при действии 4 мкМ K2CrO4 снижается по мере увеличения числа пассажей, т.е. по мере старения культуры. Мы дополнили эти данные, сравнив изменения количества клеточной РНК при действии 4 мкМ K2CrO4 для пяти культур на 5 и 22 пассажах (рис. 9). Для всех штаммов на 22-м пассаже («постаревшие» клетки), за исключением 2206 (донору 21 год), наблюдается достоверное снижение количества РНК при действии 4мкМ хромата, т.е. тот же эффект, что и для фибробластов 5-го пассажа для 52-летних доноров. Полученный результат достаточно интересен. Наши данные и данные других авторов показали, что репликативное старение фибробластов не зависит от возраста донора кожи. Однако изменения количества РНК при действии окислителя указывают на то, что «молодые» клетки доноров старше 50 лет по некоторым свойствам похожи на «состарившиеся» клетки доноров младшего возраста. Возможно, эти особенности клеток «старых» доноров, не влияя на репликативное старение в нормальных условиях, будут влиять на скорость старения, обусловленного дополнительным стрессом.
Изменения уровня апоптоза. На рис. 10 приведены данные относительного изменения величин, характеризующих апоптоз, при действии на фибробласты малых (4*4 и 6*4 мкМ*ч) доз K2CrO4. Активность каспазы 3 имеет тенденцию к снижению при действии меньшей дозы окислителя (эффект достоверен только для штамма 2208) и немного возрастает при действии большей дозы. Ранее было показано, что количество клеток с признаками апоптоза при раннем ответе на действие 4мкМ хромата не увеличено по сравнению с контролем (Вейко Н.Н., Терехов С.М. и соавтр., 2005).
Рис. 10. Изменения активности каспазы 3 (темные столбики) и количества вкДНК (светлые) клеток 5-го пассажа в присутствии малых доз K2CrO4. За единицу приняты значения соответствующих параметров клеток в отсутствие K2CrO4.
На фоне незначительных изменений активности каспазы 3 при действии 6 мкМ K2CrO4 возрастает количество вкДНК. Исключение составляет штамм 2212, для которого наблюдается значительное снижение количества вкДНК по отношению к контролю при обеих дозах хромата. Одной из причин увеличения количества вкДНК может быть ускорение процесса деградации уже апоптотических клеток при действии окислительного стресса. Нельзя также исключить, что при действии малых доз окислителя в ответ на дополнительный стресс происходит синтез новых последовательностей генома (Gahan C.G. et al., 2008). Изменения количества вкДНК при действии K2CrO4 коррелируют с маркерами репликативного старения (МЧП и содержанием ТП в геноме (k = 0,85, р = 0,05, N=5)). Максимальное увеличение количества вкДНК при действии 4мкМ хромата наблюдается у клеток штаммов с высоким содержанием ТП, т.е. у штаммов с замедленным репликативным старением. Мы не обнаружили какой-либо зависимости между изменениями параметров, характеризующих апоптоз относительно контроля, и свойствами комплекса РГ.
«Поздний» ответ фибробластов на действие хромата калия. Известно, что смена среды культивирования индуцирует пролиферацию в контрольных субконфлуентных клетках и арест клеточного цикла и апоптоз в экспонированных клетках (Pritchard D.E., 2001). Исследование кинетики изменения маркеров апоптоза, проведенное ранее на фибробластах здорового молодого донора, показало, что максимальные изменения наблюдаются на 72 часу культивирования после смены среды, в которой клетки инкубировали 24 часа (4 и 6 мкМ K2CrO4) (Вейко Н.Н., Терехов С.М. и соавтр., 2005). В нашей работе мы воспроизвели эти условия.
Уровень апоптоза клеток через 72 часа после стимуляции апоптоза путем смены среды мы оценили по активности каспазы 3 и количеству фрагментов вкДНК в среде культивирования. Абсолютные значения активности каспазы 3 в клеточных лизатах экспонированных клеток зависят от маркеров старения (рис. 11): чем выше содержание ТП в геноме штамма (МЧП), тем меньшее число клеток подвергается апоптозу при действии окислительного стресса. Свойства комплекса РГ не влияют на абсолютные значения активности каспазы 3.
Однако относительные изменения активности каспазы 3 при действии K2CrO4 меньше в клетках, геном которых содержит большие количества АкРГ (рис. 12а) и не зависят от маркеров старения. Аналогичную зависимость мы наблюдали для другого маркера апоптоза - вкДНК (рис. 12б).
Относительные изменения количества вкДНК при действии 6 мкМ хромата по сравнению с контролем (клетки без хромата) тем больше, чем меньше активных копий РГ содержит геном.
Таким образом, интенсивность апоптоза клеток, вызванного окислителем, определяется маркерами старения (содержанием ТП, МЧП), которые отражают способность клетки противостоять окислительному стрессу (Fuster J.J. et al., 2006; Duan J. et al., 2005; Houben J.M. et al., 2008). Относительные изменения уровня апоптоза в культуре клеток при действии окислителя зависят от количества активных копий РГ в геноме. Можно ожидать, что из двух штаммов клеток, которые характеризуются одинаковыми маркерами старения, более устойчивой к индуцируемому внешним воздействием апоптозу будет культура с большим количеством активных копий РГ в геноме.
Рис. 12. Зависимость изменения активности каспазы 3 (а) и количества вкДНК (б) в экспонированных клетках относительно контроля от количества АкРГ в геноме штамма. Условия: а - приводятся средние значения для двух концентраций хромата; б - клетки инкубировали в присутствии 6мкМ хромата.
Количество АкРГ и активность нуклеаз в лизатах клеток. Исследования нуклеазной активности (НА) имеют прямое отношение к проблеме старения. С возрастом увеличивается уровень апоптоза клеток, возрастает количество вкДНК. В составе вкДНК накапливаются неметилированные CpG-богатые фрагменты, в том числе и рибосомные гены, которые могут выступать в роли лигандов для рецепторов TLR9, стимулируя синтез цитокинов и вызывая дополнительный окислительный стресс. С возрастом концентрация РГ в сыворотке крови возрастает, особенно при заболеваниях, связанных с увеличением гибели клеток (Вейко Н.Н. и соавтр., 2007, 2008). Поскольку количество неметилированных копий РГ пропорционально количеству активных копий, то чем больше количество АкРГ, тем большее количество фрагментов РГ - лигандов TLR9 будут переходить в состав вкДНК при апоптозе одной клетки. Для «нейтрализации» (путем гидролиза) этих фрагментов необходима повышенная НА. Анализируемые штаммы фибробластов представляют удобную модель для проверки предположения о влиянии количества АкРГ на уровень НА клеток.
Мы охарактеризовали НА клеточных лизатов интактных клеток и показатель, отражающий степень фрагментации вкДНК (табл. 2). Основным ферментом, обуславливающим тестируемую в наших условиях Mg2+-зависимую эндонуклеазную активность, является ДНКаза1 (Campbell V.W., Jackson D.A., 1980). Экспрессия этого фермента увеличивается при гипоксии клеток (Kominato Y. et all., 2007). Известно, что ДНКаза 1 играет существенную роль в процессе элиминации фрагментов вкДНК из организма (среды культивирования).
Уровень НА в клетках при различных условиях культивирования. 5 штаммов клеток 5-го пассажа мы разделили на две группы - с малым количеством АкРГ (2207, 2207 и 2211) и большим (2208 и 2212).
Рис. 13. Средние значения НА (А-Г) и показателя фрагментации (а-г) в группе клеток с относительно малыми (светлые столбики) и большими (темные) количествами АкРГ (усл.ед.) в геноме. Варианты: А,а - стандартное культивирование; Б,б - действие малых доз (приводятся средние значения для двух доз) K2CrO4; В,в и Г,г - апоптоз, вызванный соответственно действием 4 мкМ или 6 мкМ K2CrO4 («поздний ответ»). (*) -отмечены значения, которые различаются с вероятность p < 0,05.
Для этих групп были определены средние значения показателя фрагментации и НА (рис. 13). При стандартных условиях культивирования значения НА (рис. 13А) и уровень фрагментации ДНК (рис. 13а) в клетках с большим количеством АкРГ примерно в 2 раза выше, чем в клетках с низким количеством АкРГ. «Ранний» ответ на действие хромата калия (4 часа, 4 или 6 мкМ) сопровождается значительным снижением НА клеток (рис. 13Б). Вероятно, окислительный стресс уменьшает возможности клеток эффективно деградировать вкДНК. Значения НА и степени фрагментации (рис. 13б), как и в случае спонтанного апоптоза клеток, зависят от количества АкРГ в геноме. Уровень НА клеток, в которых протекает процесс апоптоза («поздний» ответ), индуцированный 4мкМ (рис. 13В) или 6 мкМ (рис. 13Г) K2CrO4 также положительно коррелирует с количеством в геномах штаммов АкРГ. Таким образом, для трех состояний клеток (стандартное культивирование, «ранний» и «поздний» ответ на окислительный стресс) мы обнаружили одни и те же закономерности: уровень Mg2+-зависимой нуклеазной активности клеток в штаммах с высоким относительным количеством АкРГ значительно выше, чем в клетках с низким количеством АкРГ. В большинстве случаев это соответствует более высокой степени фрагментации вкДНК.
Заключение
В основе большинства теорий старения лежит предположение об определяющей роли окислительного стресса, который вызывается как эндогенными причинами (функционирование митохондрий), так и экзогенными (действие окружающей среды и образа жизни). Устойчивость организма (клетки) к действию свободных радикалов и, следовательно, скорость старения, ассоциированные со старением заболевания и продолжительность жизни - это производная функционирования большого числа генов, среди которых весьма трудно выделить определяющие процесс естественного старения. Свойства комплекса РГ индивида (клетки) - это фон, на котором развивается клеточный ответ на окислительный стресс. Для эффективного ответа на стресс клетке необходимо достаточное количество рибосом, которые обеспечат синтез нужного количества белков, участвующих в процессах детоксикации, репарации и апоптоза поврежденных клеток. Именно поэтому рибосомные гены давно привлекают внимание исследователей процесса старения.
Количество активных копий РГ в геноме - определяющая характеристика РГ, напрямую связанная с количеством клеточной РНК. Мы обнаружили, что для группы СВ по сравнению с ГС наблюдается сужение распределения по количеству АкРГ (рис. 14). Данные многолетних наблюдений сотрудников лаборатории Общей цитогенетики ГУ МГНЦ РАМН, а также данные литературных источников говорят о том, что относительное количество АкРГ (количество копий РГ в потенциально-активной фракции РГ (Conconi A., 1992)) в геноме клеток - врожденная характеристика организма, не изменяющаяся с возрастом.
Рис. 14. Сравнение распределений по количеству АкРГ для выборки СВ (белое поле), группы среднего возраста (светло-серый цвет), группы больных ревматоидным артритом ((Шубаева Н.О., 2003), темно-серый цвет) и больных шизофренией ((Вейко Н.Н., Еголина Н.А. и соавтр., 2003), черный цвет).
Таким образом, сужение распределения по количеству АкРГ в группе СВ говорит о том, что до 80 лет не дожили индивиды с минимальными и с максимальными количествами АкРГ в геноме. Мы предположили, что индивиды с малым количеством АкРГ (менее 16,5 усл.ед.) не доживают до старческого возраста, в том числе и потому, что их клетки обладают сниженной устойчивостью к окислительному стрессу. Относительно небольшие повреждения клеток сопровождаются индукцией апоптоза, что приводит к более раннему старению органов и тканей. Это предположение подтвердилось при исследовании действия окислительного стресса, вызываемого малыми дозами хромата калия, на 5 линий фибробластов кожи доноров с различным количеством АкРГ в геноме. Относительные изменения в уровне показателей апоптоза при действии на клетки с низкими количествами АкРГ были в несколько раз больше, чем в клетках с большими количествами АкРГ. Аналогичные данные были получены ранее для фибробластов кожи больных ревматоидным артритом (РА) (Шубаева Н.О., 2003). В этой связи интересно отметить, что у большей части больных РА, который является социально значимым заболеванием, сокращающим продолжительность жизни на 10-15 лет, ранее наблюдали более низкие, чем у возрастной нормы, количества АкРГ в геноме (см. рис. 14). Больные РА составляют подгруппу людей с низкими количествами АкРГ среди людей среднего и молодого возраста, которые, при прочих равных условиях, имеют вероятность не дожить до 80 лет.