Материал: Инженерная энзимология_лекция
Рекомбинация фрагментов гена in vitro
Отличие от случайного мутагенеза
•Дает возможность одновременно улучшать сразу несколько параметров в
отличие от случайного мутагенеза
•Благодаря рекомбинации полезные
мутации, содержащиеся в разных генах, могут объединиться в одном.
•Продуктом такого гена будет
фермент, обладающий наряду с высокой каталитической активностью повышенной устойчивостью.
Данный методический прием позволяет быстро накапливать полезные мутации, идентифицированные в отдельных генах.
В результате рекомбинации элиминируются нежелательные (повреждающие) мутации
Примеры успешного применения направленной эволюция ферментов
Повышение термостабильности фермента.
Путем сравнения последовательностей мезофильного и термофильного вариантов α-амилазы была обнаружена мутация, стабилизирующая фермент. Комбинируя эту мутацию с новыми мутациями(полученными с помощью случайного мутагенеза) удалось увеличить
термостабильность амилазы на 11 °С. Кроме того, время ее полужизни при 90°С выросло в девять раз.
Повышение стабильности и активности фермента в органических растворителях.
В результате направленной эволюции был получен субтилизин Е, активность которого в 60 %-ном диметилформамиде была существенно выше, чем активность “дикого” фермента в водной среде.
В настоящее время значительное развитие получил перспективный подход к получению высокоактивных белков, основанный на использовании методов компьютерного молекулярного дизайна (технология
молекулярного докинга).
В качестве примера можно привести работу сотрудников биологического факультета МГУ по созданию эффективных биокатализаторовферментов, значительно превосходящих природные аналоги.
В качестве модели был взят фермент
пенициллинацилаза из Е.
Coli, который широко применяется в фармацевтических производствах для получения полусинтетических пенициллинов.
Его химическая и пространственная трехмерная структура известна. С помощью специально разработанной компьютерной программы было смоделировано улучшение свойств этого фермента. Для повышения активности и специфичности фермента виртуально варьировались аминокислотные остатки его активного центра, которые участвуют в связывании субстрата. Для каждой мутации проверялось (виртуально, методом молекулярного докинга) сродство новой формы активного центра фермента к субстрату
Мерой сродства служила величина энергии связывания субстрата с виртуальной молекулой фермента. Среди 3000
виртуальных форм фермента обнаружены мутантные формы,
связывающие субстрат почти в 100 раз лучше природного фермента.
Зная структуру такого высокоэффективного мутанта можно искусственно
сконструировать фрагмент ДНК, кодирующий его аминокислотную последовательность и в дальнейшем клонировать и
выбранных клетках-хозяине
ГETEPOГEHHЫE КАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ И КЛЕТОК
Процесс создания гетерогенных катализаторов путем связывания ферментов с носителями различной химической природы получил название иммобилизации.
Иммобилизованные ферменты более стабильны, используются многократно, активны в органических растворителях.