Материал: Инженерная энзимология_лекция
Рациональная инженерия
Выбор сайта мутации
Синтез олигонуклеотида, кодирующий новый аминокислотный остаток
Получение плазмиды, несущей олигонуклеотид
Получение клеток (трансфекция), в которых осуществляется биосинтез мутантного белка
При рациональной инженерии используются следующие подходы для получения ферментов со стабильной
конформацией и активностью:
• Стабилизация гидрофобного ядра
Данные CAST web-сервера позволяют определить какие аминокислотные замены необходимо произвести, чтобы удалить или уменьшить объем полостей в гидрофобной области, что повышает термостабильность фермента
• Уменьшение подвижности полипептидной цепи
Замена Гли на Ала (участвующим в гидрофобной стабилизации белка), замена
остатков АМК в местах изгиба цепи на Про (обладает жесткой конформацией), создание S-S- связей путем замены двух аминокислотных остатков на 2 Цис (пример: T4 лизоцим - данный подход повысил его термостабильность)
Замена аминокислотных остатков в активном центре
Замена Мет-222 на неокисляемую АМК в активном центре повышает устойчивость субтилизина BPN (ферментная добавка в моющих средствах) к действию пероксида водорода
Направленная эволюция ферментов
В отличие от рациональной инженерии,
направленная эволюция ферментов не требует информации о
структуре фермента, знания механизмов его инактивации или понимания молекулярных основ его стабильности.
Направленная эволюция ферментов
Создание библиотеки мутированных генов ферментов
Экспрессия генов в микробном хозяине
Скрининг или селекция продуктов экспрессии генов, для которых зафиксировано улучшение желаемого параметра
Рекомбинация фрагментов генов, кодирующих ферменты с улучшенными свойствами, с целью накопления полезных мутаций
Рекомбинация фрагментов гена in vitro (перемешивание ДНК или сексуальная ПЦР
DNA-shuffling or sexual PCR):
•ДНК, кодирующую различные варианты фермента, амплифицируют с помощью ПЦР
•амплифицированную ДНК фрагментируют случайным образом с помощью ДНКазы I
•пул образовавшихся фрагментов снова подвергают
ПЦР, в ходе которой фрагменты выступают друг для друга праймерами
•получают семейство последовательностей ДНК,
содержащих различные комбинации мутаций.