Статья: Иммунофенотип макрофагальной популяции при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких

Примечание. C -- слабоактивные макрофаги, У -- умеренно активные макрофаги, В -- высокоактивные макрофаги; +++-- выраженная реакция, +/ слабая реакция.'различие по отношению к группе контроля; # различие по отношению к группе с активным бактериовыделением (р < 0,05). Note. C-weakly active macrophages, M -- moderately active marcophages, H -- highly active macrophages; +++-- pronounced reaction, +/ weak reaction.

''"statistically significant difference as opposed to the control group; # statistically significant difference as opposed to the group with intense bacterial excretion (p < 0.05).

При анализе экспрессии СБ68 у пациентов с клиническим абациллированием данные клеточные соотношения варьировались в зависимости от наличия либо отсутствия пиогенного слоя. Так, у пациентов с повышенной реактивностью (неравномерные наложения казеозных масс на внутренней стенке каверны) третью часть всех макрофагов составляли слабоактивные. Однако у пациентов с двухслойной каверной количество высоко- и слабо активированных клеток в большинстве случаев выравнивалось (соотношение 1 : 1) за счет стабилизации экссудативно-альтеративных процессов.

В результате анализа ИГХ реакции с маркером VEGF-A в стенке каверны установлена стойкая диффузная окраска казеозного некроза. Цитоплазматическая экспрессия зафиксирована в клетках гистиоцитарного происхождения, в результате чего нами было определено два иммунофенотипа макрофагов: тип 1 (С068+/УЕОР-) и тип 2 (СЕ>68+/УЕОР+) (табл. 2).

Таблица 2 Тable 2

* различие по отношению к группе контроля (р < 0,05); # различие по отношению к группе с активным бактериовыделением (р < 0,05).

''"statistically significant difference as opposed to the control group (p < 0.05); # statistically significant difference as opposed to the group with intense bacterial excretion (p < 0.05).

Клетки СЕ>68+/УЕОР локализовались преимущественно в зоне специфической грануляционной ткани на границе с пиогенным слоем и верифицировались как высоко или умеренно активированные. Слабоактивные С068+/УЕОР+ фиксировались на границе перехода грануляций в фиброзный слой.

На границе фиброзного слоя и окружающей перикавернозной зоны в обеих группах микроскопически определялась выраженная лимфоидная инфильтрация с формированием лимфоидных фолликулов как с активными светлыми герминативными центрами, так и относительно мономорфными по своей структуре. Во всех наблюдениях установлено, что из общего числа позитивно окрашенных макрофагов в фиброзном слое 70% локализованы в непосредственной близости от лимфоидных формирований.

Количество клеток УЕОР+ в зоне лимфоидных фолликулов прямо коррелировало с количеством макрофагов СИ68+ в перикавернозной зоне (Я = 0,68) и отмечалась отрицательная корреляционная связь по отношению к количеству УЕОР+ диффузно рассеянных клеток в фиброзной капсуле (Я = -0,75). Клетки С068+/УЕОР+ визуализировались в зоне СИ8+ Т-лимфоцитов, а С068+/УЕОР- - в зоне скоплений клеток СИ4+ (рис. 2).

Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция с маркерами VEGF-A: a - CD68, *200; b - CD4, *200; c - CD8, *400;

d - в фиброзном слое каверны в области лимфоидных агрегатов, * 400 Fig 2. Immunohistochemical reaction with markers of VEGF-A: a - CD68, *200; b - CD4, *200; c - CD8, *400; d - in the fibrous cavern layer in the area of lymphoid cell aggregates, *400

У всех пациентов группы ФКТ МБТ+ в дренирующем бронхе с типичным трехслойным строением максимальное количество высокоактивных макрофагов СИ68 определялось в устье - (103,00 ± 1,2) позитивно окрашенных клетки. В окружающих участках серозной пневмонии регистрировался высокий уровень ИГХ экспрессии СИ68 в виде очаговых скоплений высокоактивных (38,34 ± 1,1) и умеренно активных (29,32 ± 0,8) альвеолярных макрофагов и пенистых клеток, что свидетельствует об активизации гистиоцитарного пула в связи с прогрессией воспаления.

В участках частичного либо тотального спадения альвеол наблюдалась экспрессия высокоактивных альвеолярных макрофагов СИ68+ в небольшом количестве, в основном фиксированных в альвеолярных нишах. В строме альвеолярных перегородок зоны дистелектаза среди хронического лимфо-гистиоцитарного инфильтрата определялось около 22% тканевых макрофагов

СЭ68+ с низкой функциональной активностью (19,08 ± 0,7), которые соответствовали клеткам УБОР+ (рис. 3).

Рис. 3. Распределение слабоактивных макрофагов CD68+ в сопоставлении с VEGF+ клетками при фиброзно-кавернозном туберкулезе Mycobacterium tuberculosis +

Fig. 3. Distribution of weakly active CD68+ macrophages compared with VEGF+ cells under fibrous cavernous pulmonary tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis +

В очагах эмфизематозного вздутия определялось минимальное количество позитивно окрашенных макрофагов ((9,16 ± 0,4) при ФКТ МБТ+ и (9,11 ± 0,4) при ФКТ МБТ-) в сравнении со всеми вышеописанными зонами независимо от активности бактериовыделения. В основном это были альвеолярные макрофаги со слабой функ циональной активностью, фиксированные на альвеолярной поверхности - (8,01 ± 0,4) и (7,29 ± 0,4) клеток VEGF+ соответственно. В просвете расширенных альвеол с истонченными перегородками свободно лежащих позитивно экспрессирующих маркеров CD68 либо клеток VEGF не обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ

В современной медицине имеется большое количество научных работ, посвященных изучению патоморфоза различных форм туберкулеза, часть из них имеет экспериментальный характер, и лишь немногочисленные исследования отображают патогенетические аспекты in vivo, что связано, в том числе, и со сложностью забора материала для исследования [12]. Многочисленные научные работы посвящены клиническим сопоставлениям показателей активности туберкулеза в периферической крови пациентов [13, 14]. Однако они не являются показательными с точки зрения специфичности процесса и его локализации, так как практически невозможно сформировать «чистую» группу пациентов без сопутствующей патологии и, соответственно, определить истинную причину прогрессирующей иммунологической недостаточности [5, 16]. С этой точки зрения иммуногистохимические и молекулярно-генетические исследования более перспективны, поскольку отражают состояние клеточного звена локального иммунитета, межклеточных взаимодействий и особенностей их регуляции в реальных условиях непосредственно в очаге поражения и в окружающей легочной паренхиме.

В нашем исследовании в результате проведенного комплексного морфологического анализа образцов легких пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулезом в зависимости от активности бактериовыделения установлена популяционная неоднородность клеток гистиоцитарного происхождения в зависимости от степени активации кластера дифференцировки 68 или макросиали- на, который является членом семейства скавэн- джер-рецепторов (ScR) и широко используется как маркер макрофагов. Макросиалин, локализуясь на цитоплазматических гранулах, содержащих лизосомально-эндосомально ассоциированный мембранный гликопротеин 1 (LAMP-1), является показателем активации макрофагов в ответ на различные воспалительные стимулы [17].

Нами выделено три типа активности клеток CD68 на основании интенсивности реакции в условиях туберкулезного процесса: высокий, умеренный и слабый. Высокоактивные клетки CD68+ с интенсивным мембранно-цитоплазматическим окрашиванием, компактными и тесно расположенными зернами в цитоплазме свидетельствуют о гиперактивации макрофагов на фоне хронической стимуляции бактериальным липо- полисахаридом и неэффективности фагоцитоза M. tuberculosis и персистенции ее внутриклеточного паразитирования.

Слабоактивные макрофаги CD68 с нечеткой мембранной экспрессией и слабым диффузным окрашиванием цитоплазмы, единичными рассеянными зернами либо готовятся к фагоцитозу микобактерий, либо находятся в состоянии покоя. иммунофенотип макрофагальный популяция туберкулез

Уменьшение количества высокоактивных на основании интенсивности окраски клеток CD68+ и параллельное нарастание пула слабоактивных макрофагов по мере отдаления от очага кавернозной деструкции позволило предположить наличие различных функциональных обязательств данных клеток не только в отношении фагоцитоза и презентации антигена иммунокомпетентными клетками, но и возможного противовоспалительного действия и ремоделирования окружающей легочной паренхимы.

Данное заключение базируется и на основании известного факта полиморфизма популяции макрофагов в условиях in vitro и in vivo у экспериментальных животных. Идентифицированы два фенотипа макрофагов: М1 (макрофаги 1-го типа, классически активированные) и М2 (макрофаг иго типа, альтернативно активированные) [18].

М1 - провоспалительные или цитотоксические, продуцируют интерлейкин (ИЛ) 12, индуци- бельный оксид азота (iNOS), миелоид-зависимый протеин (MRP) 8/14 и фактор некроза опухоли (TNF) а, металлопротеиназу (ММР) 9, интерферон (ИФН) у и потенцируют развитие клеток Th0 в Th1 [19]. М2 - противовоспалительные, продуцируют ИЛ-4, ИЛ-10, сосудистый фактор роста (VEGF), экспрессируют на поверхности маркера активации макрофагов CD163 и др. Это тип клеток интегрирован в ^2-ответ [20].

В нашем исследовании фрагменты легких пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулезом клетки CD68+/VEGF- локализовались преимущественно в зоне специфической грануляционной ткани на границе с пиогенным слоем, в устье дренирующего бронха, очагах серозной пневмонии и верифицировались как высоко- или умеренно активные. Зафиксированное статистически значимое превалирование таких клеток у пациентов с активным бактериовыделением в сравнении с группой ФКТ МБТ- обусловлено интенсификацией цитотоксических механизмов в связи с прогрессией альтеративно-экссудативных реакций, массивной бактериальной инсеминацией и необходимостью активизации фагоцитоза.

Клетки VEGF+ - слабоактивные макрофаги CD68+ - фиксируются на границе перехода грануляций в фиброзный слой, перикавернозной зоне и интактной легочной ткани со статистически значимым преобладанием у пациентов с МБТ- (рис. 4).

Независимо от активности бактериовыделения клетки VEGF+ в зоне лимфоидных фолликулов прямо коррелируют с количеством макрофагов CD68+ в перикавернозной зоне (R = 0,68) и обратно - с числом VEGF+ диффузно рассеянных клеток в фиброзной капсуле (R = -0,75). При этом CD68+/ VEGF+ визуализируются в зоне CD8+ Т-лимфоци- тов, а CD68+/VEGF- - в зоне скоплений клеток CD4+. Такой характер корреляционной взаимосвязи свидетельствует о перераспределении макрофагов во 2-й тип, обладающих ремоделирующим действием на окружающие ткани при потенцирующем участии клеток лимфоидной популяции.

Слабоактивные CD68 VEGF

Weakly active CD68

Рис. 4. Распределение слабоактивных макрофагов CD68+ в сопоставлении с клетками VEGF+ при фиброзно-кавернозном туберкулезе Mycobacterium tuberculosis-

Fig. 4. Distribution of weakly active CD68+ macrophages compared with VEGF+ cells under fibrous cavernous pulmonary tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis-

По мере удаления от очага специфического воспаления происходит инверсия макрофагальной активности от провоспалительной к противовоспалительной. Такое функциональное перераспределение связано со снижением бактериальной инсеминации тканей и, возможно, является следствием индуктивной перестройки самих макрофагов микобактериями, направленной на одновременную маскировку от цитотоксического клеточного ответа и ремоделирование легочной ткани с целью создания комфортного микроокружения и достаточной аэрации в очаге специфического воспаления. Такая многозадачность реализуется с помощью механизма «ареста созревания фаголизосом», блокировки рецептора MHCI, активизации рецептора MHCII, что приводит к последующей дифференцировке клеток

Th0 в Th2 и перепрограммированию макрофагов в М2 с противовоспалительной функциональной направленностью. Как показано в наших предыдущих исследованиях процессов васкуляризации в условиях кавернозного туберкулеза, именно макрофаги VEGF+ путем гиперпродукции сосудистого фактора роста А приводят к разрастанию неполноценных в функциональном отношении сосудов с несформированной базальной мембраной и повышенным индексом проницаемости непосредственно в очагах специфического воспаления [21, 22]. В то же время векторное популяционное перераспределение макрофагов во 2-й тип в интактной легочной ткани также приводит к неэффективной гемодинамической микроциркуляции за счет нарушения сосудистой проницаемости и нарастания тканевой гипоксии. Далее происходит формирование альвеоло-капиллярного блока и прогрессирующего пневмофиброза, замыкая «порочный круг» клинической прогрессии бронхолегочной недостаточности.