Статья: Иммунофенотип макрофагальной популяции при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких

Крымский федеральный университет (КФУ) имени В.И. Вернадского

Россия, Республика Крым

Иммунофенотип макрофагальной популяции при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких

Голубинская Е.П., Филоненко Т.Г., Кубышкин А.В., Ермола Ю.А., Кальфа М.А., Геращенко А.В., Крамарь Т.В.

Медицинская академия имени С.И. Георгиевского

РЕЗЮМЕ

Цель исследования: изучение иммунофенотипа макрофагальной популяции и механизмов их векторного перераспределения при фиброзно-кавернозном туберкулезе легких.

Материалы и методы. Материалом для исследования явились фрагменты стенки каверны и перикавернозной легочной ткани прооперированных по поводу фиброзно-кавернозного туберкулеза (ФКТ) легких (n = 163). Все пациенты были разделены на две основные группы (с активным бактериовыделением (МБТ+, n = 84) и клиническим абациллированием (МБТ-, n = 79)) для проведения иммуногистохимического исследования с панелью маркеров: макрофагов и гистиоцитов - CD68; сосудистого фактора роста А - VEGF-A; Т-хелперов CD4, цитотоксических Т-лимфоцитов CD8.

Результаты. При анализе экспрессии маркера CD68 установлена популяционная неоднородность макрофагов в зависимости от интенсивности цитоплазматической реакции функциональной активности с различными локализационными и количественными характеристиками: высокоактивные (тип 1), умеренно активные (тип 2) и слабоактивные (тип 3). На основании реакции с сосудистым фактором ростом A определено, что клетки VEGF+ соответствуют слабоактивным макрофагам CD68+ и локализуются на границе перехода специфической грануляционной ткани в фиброзный слой, перикавернозной зоне и интактной легочной ткани со статистически значимым преобладанием у пациентов с МБТ- (р < 0,05). Независимо от активности бактериовыделения число клеток VEGF+ в зоне лимфоидных фолликулов прямо коррелирует с количеством макрофагов CD68+ в перикавернозной зоне (R = 0,68) и обратно - с числом VEGF+ диффузно рассеянных клеток в фиброзной капсуле (R = макрофагов 0,75). При этом CD68+/VEGF+ визуализируются в зоне CD8+ Т-лимфоцитов, а CD68+/VEGF- - в зоне скоплений клеток CD4+. Такой характер корреляционной взаимосвязи свидетельствует о перераспределении макрофагов во второй тип, обладающих ремоделирующим действием на окружающие ткани при потенцирующем участии клеток лимфоидной популяции.

Ключевые слова: фиброзно-кавернозный туберкулез, макрофаги, иммунофенотип, иммунитет, иммуногистохимия.

Immunophenotype of the macrophage population in fibrous, cavernous pulmonary tuberculosis

Golubinskaya E.P., Filonenko T.G., Kubyshkin A.V., Yermola Yu.A.,

Kalfa M.A., Gerashchenko A.V., Kramar T.V.

Medical Academy named after S.I. Georgievsky, Crimean Federal University (СFU) named after Vernadsky 5/7, Lenin Blv, Simferopol, 295051, Republic of Crimea, Russian Federation

ABSTRACT

Objective: to study the immunophenotype of the macrophage population and the mechanisms of their vectorial redistribution in fibrous cavernous pulmonary tuberculosis.

Materials and methods. The material for the study was fragments of the fibrous cavern wall and pericavernous lung tissue of the dead or surgical patients diagnosed with fibrous cavernous tuberculosis (n = 163). All patients were divided into 2 main groups: patients with active bacteria excretion (MTB+, n = 84) and patients with clinical abacillation (MTB-, n = 79) for immunohistochemistry with a panel of markers for: macrophages and histiocytes - CD68; vascular growth factor A - VEGF-A; T-helpers - CD4, and T-cytotoxic lymphocytes - CD8.

Results. Following the analysis of CD68 expression, the population heterogeneity of macrophages was revealed depending on the intensity of the cytoplasmic reaction, functional activity, localization and quantitative characteristics. Three groups were identified: highly active, moderately active and weakly active. Based on the reaction with vascular growth factor A, it was determined that VEGF+ cells correspond to weakly active CD68+ macrophages and are located on the border between the specific granulation tissue and fibrous layer as well as in the pericavernous zone and intact lung tissue with a statistically significant predominance in patients with MTB- (p < 0.05). Regardless of the scope of bacterial secretion, the number of VEGF+ cells in the lymphoid follicle zone directly correlates with that of CD68+ macrophages in the pericavernous zone (R = 0.68) and indirectly correlates with the number of diffusely scattered VEGF+ cells in the fibrous capsule (R = -0.75). In the meantime, CD68+/VEGF+ are visualized in the zone of CD8+ T-lymphocytes, and CD68+/VEGF~ - in the zone of CD4+ cell clusters. Such correlation indicates the redistribution of macrophages into type 2, which has a remodeling effect on the surrounding tissues with the potentiating participation of lymphoid cells.

Key words: fibrous cavernous pulmonary tuberculosis, macrophages, immunophenotype, immunity, immunohistochemistry.

ВВЕДЕНИЕ

Неуклонный рост числа пациентов с различными формами туберкулезной инфекции, в том числе в ассоциации с ВИЧ-инфекцией, вызвал бум научных исследований в направлении иммунологии туберкулеза [1, 2]. Достоверно установлена взаимосвязь прогрессирования альтеративно-экс- судативных реакций и уровня иммунодефицита по мере уменьшения количества клеток CD4+ [3, 4]. Однако в условиях длительно протекающего туберкулезного процесса без коморбидной патологии отмечается формирование иммунопатологических состояний. Ряд зарубежных исследователей предполагают, что вторичная иммунологическая недостаточность при туберкулезе может быть детерминирована непосредственно Mycobacterium tuberculosis (МБТ) путем инициирующего воздействия на дендритные и другие антигенпрезентирующие клетки, в частности макрофаги, что запускает каскадный цикл выброса цитокинов, хемокинов и других активных веществ, изменяющих соотношение провоспалительных и противовоспалительных механизмов [5, 6].

В экспериментальных работах in vitro установлен факт популяционной функциональной неоднородности макрофагов и выделены два основных фенотипа. Считается, что макрофаги первого типа (М1) инициируют воспалительную реакцию, проявляя высокую цитотоксическую и бактерицидную активность и поддерживая Thl-зависимый иммунный ответ. В то же время клетки М2 участвуют в реструктуризации межклеточного матрикса за счет активизации межклеточных взаимодействий с фибробластами и эндотелио- цитами, приводя к разрастанию соединительной ткани и неоангиогенезу в очаге поражения [7-9].

Наличие данных о полиморфизме популяции макрофагов позволяет предположить, что последующая цепь клеточных взаимодействий и их синтетической активности приводит к формированию гиперчувствительности замедленного типа и необратимому ремоделированию легочной паренхимы с развитием деструктивных изменений в виде формирования полости распада и массивной диссеминации патогена [10]. Именно изучение функциональных особенностей макрофагов, их координации с другими клеточными элементами системы местной защиты легких (потенцирующее либо блокирующее воздействие на процессы кол- лагенообразования, неоангиогенез, сурфактантная система) может позволить составить персональный макрофагальный профиль больного с возможностью оценки эффективности терапии либо прогрессирования заболевания. В связи с чем целью нашего исследования явилось изучение иммунофенотипа макрофагальной популяции и механизмов их векторного перераспределения при фиброзно-кавернозном туберкулезе (ФКТ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования явились фрагменты стенки каверны и перикавернозной легочной ткани прооперированных по поводу ФКТ легких (п = 163). Все пациенты были разделены на группы: группа 1 - ФКТ легких с активным бактериовыделением (МБТ+), п = 84; группа 2- ФКТ легких с клиническим абациллированием (МБТ-), п = 79. В качестве контрольной группы для сравнения морфологических показателей были использованы фрагменты легких 30 больных, умерших от патологии, не связанной с заболеваниями легких (инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения). Критерии включения пациентов в исследование: возраст 18-65 лет, отрицательные клинико-лабораторные данные наличия коморбидной патологии (вирусных гепатитов В, С и ВИЧ), обострения хронических заболеваний других органов и систем, информированное согласие.

Для стандартного гистологического исследования фрагменты стенки каверны, перикаверноз- ной зоны и макроскопически интактной легочной ткани фиксировались в 10%-м нейтральном формалине с последующей парафинизацией и изготовлением серийных срезов толщиной 4-5 мм. Визуализация патологических изменений осуществлялась путем окраски гематоксилином и эозином [11].

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили по стандартизованной методике с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 3-5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полизином (Menzel-Glaser, Германия) и реактивов компании Dako (Дания). ИГХ панель включала в себя следующие антитела: маркер макрофагов и гистиоцитов, кластер диф- ференцировки 68, макросиалин - CD68 (клон KP1), маркер сосудистого фактора роста А VEGF-A (клон VG1), маркер кластера дифференцировки лимфоцитов Т-хелперов CD4 (клон 4В12), маркер кластера дифференцировки лифоцитов Т-цито- токсических CD8 (клон С8/144В). Система визуализации EnVisionTMFLEX на автостейнере фирмы Dako.

Количественная оценка позитивных клеток проводилась с учетом зонального распределения (зона казеозного некроза, специфическая грануляционная ткань, фиброзный слой, перикаверно- зная зона, дренирующий бронх, интактная легочная ткань) и характера взаимодействия с другими структурными элементами ткани легкого. Оценку количества клеток проводили в 10 полях зрениях при увеличении 200.

Интенсивность экспрессии макросиалина (CD68) оценивали полуколичественным методом на основании выраженности окраски и количества гранул в цитоплазме по следующей схеме: слабая (мембранная экспрессия со слабым диффузным окрашиванием цитоплазмы и рассеянным небольшим количеством зерен), умеренная (равномерно расположенные зерна в цитоплазме на фоне неравномерной мембранной реакции) и выраженная (интенсивная цитоплазматическая окраска с компактным расположением зерен).

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли с помощью светового микроскопа Olympus CX-41, Olympus digital camera C5050 zoom. Морфометрическая обработка полученных данных проводилась с помощью лицензионного программного обеспечения ImageJ.

Статистическая обработка данных выполнена с использованием программного пакета Statistica for Microsoft Windows, version 10.0. (StatSoft Inc., США). Данные представлены в виде M ± SD, где SD - стандартное отклонение. Статистический анализ включал построение вариационных рядов количественных данных, определение нормальности распределения вариационных рядов с использованием критерия Колмогорова - Смирнова, вычисление среднего арифметического значения, среднеквадратического отклонения, ошибки средней величины, коэффициента вариации и величины отклонения показателя от контроля в процентах. Статистическая значимость различий сравниваемых величин определялась при помощи однофакторного дисперсионного анализа, для сравнения двух независимых групп применяли двухвыборочный критерий Стъюдента. Для оценки статистической взаимосвязи рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В процессе рутинного гистологического исследования установлено, что макрофагальная популяция имеет структурные и количественные особенности в зависимости от приближенности к очагу деструкции. Выделено несколько микроскопически идентифицируемых видов макрофагов, имеющих различную локализацию и функциональную активность: альвеолярные и эпителиоидные макрофаги, пенистые клетки, гигантские многоядерные клетки Пирогова - Ланг- ханса. При анализе экспрессии маркера CD68 и в образцах VEGF легких изучаемых групп зафиксировано наличие стойкого диффузного окрашивания в пиогенном слое.

При оценке клеточной экспрессии указанных маркеров установлено динамическое уменьшение количества CD68+ макрофагов по мере удаления от очага некроза с пиковыми показателями в грануляционной ткани - 143,45 ± 5,27 (ФКТ МБТ+) и 117,32 ± 3,03 (ФКТ МБТ-). В прилегающей зоне эмфиземы 9,16 ± 0,45. При этом в случаях ФКТ МБТ- регистрировалась аналогичная динамика со статистически значимыми количественными межгрупповыми отличиями как относительно контрольной группы, так и ФКТ МБТ+ (рис. 1). В зоне перехода пиогенного слоя в зону специфических грануляций фиксировалось абсолютное превалирование высоко- и умеренно активных СБ68+ клеток независимо от активности бакте- риовыделения. В то же время в обеих группах слабоактивные клетки, как правило, располагались на границе перехода грануляционной ткани в фиброзный слой и соответствовали, в том числе, верифицированным гистологически пенистым клеткам и малым эпителиоидным клеткам.

Рис. 1. Распределение макрофагов CD68+ во фрагментах легочной ткани при фиброзно-кавернозном туберкулезе в зависимости от активности бактериовыделения

Fig. 1. Distribution of CD68+ macrophages in the fragments of the lung tissue under fibrous cavernous tuberculosis depending on the scope of bacterial excretion

Данная клеточная популяция с нечеткой мембранной экспрессией, слабым диффузным окрашиванием цитоплазмы и немногочисленными рассеянными зернами составляла одну четверть всех позитивных макрофагов в группе ФКТ МБТ+ (табл. 1).

Таблица 1 Тable 1