Материал: Идентификация сырьевого состава плодово-ягодной продукции молекулярно-генетическим методом

Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 5-10 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния. Для анализа необходимо 50 - 150 мкг образца.

Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить в замороженном состоянии (при температуре минус 20оC) в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа).

Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения сырья или пищевого продукта.

Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности продукта.

В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК растения (фрукта или овоща) путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК - мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК - мишени в присутствии термостабильной ДНК - полимеразы, дезоксинуклеозид - трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК - мишени.

Для получения достаточного для визуального количества копий целевого фрагмента ДНК необходимо провести 20-40 амплификации, каждый цикл из которых включает в себя 3 стадии:

Этап 1. лизис клеток (или разрушение физическим, механическим способом); ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе.

Этап 2-Денатурация - реакционную смесь нагревают при 93 - 95 С в течение 30 - 40 секунд, происходит расплетение двойной спирали ДНК с образованием одноцепочечных молекул.

Этап 3: Отжиг праймеров - комплементарное связывание праймеров с ДНК - матрицей, температура отжига специфична для каждой пары праймеров, ее значение располагается в интервале 50 - 65 С, протекает в течение 10 - 40 секунд.

Этап 4: Элонгация цепи - синтез новых цепей ДНК Taq - полимеразой путем удлинения праймеров. Протекает эта реакция при температуре 69 - 72.

С, время её зависит от размера амплифицируемого фрагмента. За 30-40 циклов амплификации в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Такого количества достаточно для визуального обнаружения ПЦР-продукта методом электрофореза в агарозном геле.

Клонирование генов и полимеразная цепная реакция (ПЦР), два биотехнологических прорывов 1970-х и 1980-х годов, по-прежнему играют важную роль в современной науке. Сегодня метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (Real Time) становится одним из наиболее популярных методов как в клинической геннодиагностике, так и в научных исследованиях. Появление генетически модифицированных организмов (ГМО) на продовольственном рынке несколько лет назад, и спрос на более точные и надежные методы для обнаружения иностранных (транс генных или патогенных) ДНК в съедобных растениях, были движущей силой для внедрения ПЦР в реальном времени методы исследований в растениеводстве. За этим последовали многочисленные фундаментальные исследовательские задачи, направленных на изучение профилей экспрессии эндогенных генов и мультигенных семей. С тех пор научный интерес к этой технике возрос в геометрической прогрессии.

Количественное определение ГМО растительного происхождения основано на расчёте отношения количества ДНК определенной линий ГМ растения к общему количеству ДНК анализируемого растения, выраженного в процентах. В каждой тест-системе для количественного определения ГМО одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке. Одна реакция позволяет обнаружить ДНК анализируемого растения (соя, кукуруза и т. п.). Другая реакция позволяет обнаружить последовательность, специфичную для конкретной линии ГМ растения. Протекание каждой реакции детектируется с помощью специфического зонда. Для обнаружения ДНК анализируемого объекта (соя, кукуруза) используется зонд, меченный красителем R6G, а для обнаружения генетической вставки - красителем FAM или ROX в зависимости от типа прибора. Определение процентного содержания ГМО происходит с использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой смеси ДНК растения дикого типа (0 % ГМО) и ДНК ГМ линии (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых образцах.

Реактивы.reagent (Лизирующий реагент), готов к применению - 1 флакон, 30 мл;buffer (Солевой буфер) - 10-кратный буфер, 1 флакон, 10 мл;. Е™ (ЭкстраГен Е, суспензия смеси гранул ионообменников), готов к применению - 1 флакон, 10 мл;™ (Нуклеос, суспензия сорбента ДНК), готов к применению - 2 пробирки по 1,0 мл.

•      (+) control (положительный контрольный образец), готов к применению - красные пробирки с лиофолизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.

•   (-) сontrol (отрицательный контрольный образец), готов к применению

-         синие пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.;

Результаты

В результате проведенного эксперимента ГМО в плодово-ягодных обнаружено не было, только показал ГМО праймер на 35s, в котором заранее было заложен измененный ген.

Праймеры на промотор 35S [26]: 35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС A 3'; 35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА 3'.

.45 Праймеры на терминатор nos [27]: nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3'; nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Таблица 1. Программа амплификации для праймеров 35S и nos

Таблица 2.Результаты исследований на содержание ГМИ в сырье и пищевых продуктах

Транс генные последовательности были обнаружены практически в каждой из групп данных продуктов, но при повторных поступлениях идентичных образцов, как правило, ГМИ не обнаруживались. Это свидетельствует об ответственном отношении производителей к качеству выпускаемой продукции

Таблица 3. Результаты исследований на содержание ГМИ в сырье и пищевых продуктах

Выводы

1. Всего нами было проанализировано 148 образцов, из них 44 - по добровольной маркировке на знак "Не содержит ГМО!".

В подавляющем большинстве исследуемых образцов (97,4%) генно-модифицированных последовательностей не обнаружено. Это свидетельствует об ответственном подходе производителей и заявителей - поставщиков детского и школьного питания - о недопустимости содержания ГМИ в продуктах для этих категорий потребителей.

В трех образцах из 148 были обнаружены генетические последовательности gus, nos, 35S, nptII в сочетаниях: gus, 35S, nptII- один образец и gus, nos, 35S- 2 образца.

Это означает применение генетически модифицированных источников в производстве данных продуктов питания (кондитерские изделия).

. Электрофарез и Метод ПЦР, позволяющий не только выявить наличие ГМИ в продуктах, но и определить их количество, на сегодняшний день является наиболее эффективным методом контроля. Предусмотрено дооснащение лаборатории комплектом оборудования для количественного определения ГМИ методом ПЦР в реальном времени.

Список литературы

1.               Вельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А,Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия, 2003,№ 2, с 74-96.

2.            Гинцбург А.Л., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса " Здоровое питание населения России" Москва, 2003, с. 123-124.

3.              ГОСТ Р' 52173-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения"

4.              ГОСТ Р 52174-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа"7. Директива ЕС 1829/20038. Директива ЕС 1830/2003

5.             Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-говсероссийского конгресса " Здоровое питание населения России" Москва, 2003, с.166-168.

6.                Ю.Иванов A.A., Галкина И.И., Мясникова В.В. Деятельность учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году). // Информационный сборник М. - Федеральный центр Госсанэпиднадзора. - 2004г. - 17 стр. 64

7.             Ивановцев В.В., Светличкин В.В., Каверин A.B. / Идентификация транс генной сои в продуктах и кормах.// Журнал "Ветеринария и кормление", Москва 2006, №6 стр. 21-22

8.            Каверин A.B. / Количественное определение ГМИ методом ПЦР в реальном времени// Труды ВНИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии", Москва, 2006, стр. 34-37

9.            Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука в Bt-защищенному картофелю// Arpo XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения., №7 с.22-24

10.              Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., с. 59-62.

11.             Лушников, К.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевой продукции / Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2,- С. 36-39.

12.             Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М., изд. "Мир"., 1994, с. 159-172.

13.             Методические указания "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной • из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги" МУК 4.2.1917-04

14.     Методические указания "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги" МУК 2.3.2.1935-04

15.             Методические указания "Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного' происхождения в продуктах питания". МУК 4.2.1913-04.

16.                  Методические указания "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции". МУК 4.2.1902-04.

18.               Постановление № 149 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 16.09.2003 .

19.            Постановление № 36 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 14.11.2001

20.              Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, 66 полученными из генетически модифицированных источников" от 31 декабря 2004г. № 13.

21.            Харченко П.Н. ДНК-технологии в биологической защите растений / П.Н. Харченко // Транс генные растения новое направление в биологической защите растений: материалы междунар. научно- практич. конференции. Краснодар, 19-22 июня 2002. Краснодар, 2003. - С. 100-105.

22.               Черкасова Н.Н. Метод получения трансгенных растений, устойчивых к патогенам / Н.Н. Черкасова, Т.П. Жужжалова, И.Л. Цветков // Сахарная свекла. 2003. - № 9. - С. 28.

23.            Чернин Л.С. Первые шаги в будущее: генная инженерия растений / Л.С. Чернин. - М.: Агропром.издат, 1990. 256 с.

24.               Чернышева О.Н. Идентификация ГМИ в пищевых продуктах: результаты мониторинга / О.Н. Чернышева, Е.Ю. Сорокина, О.В. Анисимова, Н.Н. Филатов // Пищевая промышленность. 2003. - № 6. - С. 22-23.

25.            Чесноков Ю.В. Генетическая трансформация растений: некоторые особенности проведения / Ю.В. Чесноков // Достижения науки и техники АПК. 2003. - № Ю. - С. 30-34.

26.             Шевелуха B.C. Биоинженерия - стратегическое направление в биологии и иммунитете растений / B.C. Шевелуха // Вестник защиты растений. 2003. - № 1. - С. 3-7.

27.             Advance copy of working document of the commission services on traceability and labelling of GMOs and products derived from GMOs. ENV/620/2000 // europa.eu.int/comm./food/fess/biotech/biotech01en.pdf

28.             Amanda Kumar P. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis / Amanda P. Kumar, R.P. Sharma, V.S. Malice // Adv. Appl. Microbial. 1996. -Vol. 42.-P. 1-43.