Секреция соляной кислоты слизистой оболочкой желудка обеспечивается специализированными париетальными (обкладочными) клетками, находящимися в эпителиальном слое желудочных желез фундального отдела. Характерной особенностью этих клеток является наличие специальных структур - так называемых внутриклеточных канальцев, образованных впячиваниями апикальной мембраны (рис. 1).
Рис. 1. Структура париетальной клетки. 1 - канальцы; 2 - микроворсины; 3 - митохондрии; 4 - ядро
Поверхность канальцев, как и поверхность апикальной мембраны, покрыта многочисленными микроворсинками. Наличие внутриклеточных канальцев и микроворсинок значительно увеличивает поверхность, через которую осуществляется секреция соляной кислоты. Кроме того, для париетальных клеток характерно наличие большого числа митохондрий, обеспечивающих клетку энергией в виде АТФ.
Активация секреции соляной кислоты в желудке происходит под действием нескольких секретогенов: гистамина, гастрина, ацетилхолина. Она сопровождается значительными морфологическими изменениями париетальных клеток: наблюдается увеличение размеров внутриклеточных канальцев и длины микроворсинок, что приводит к увеличению поверхности мембраны, через которую происходит секреция. В активированных париетальных клетках внутриклеточные канальцы открываются в люминальное пространство, что обеспечивает доступ выделяющейся соляной кислоты в просвет желудка.
В транспорте соляной кислоты через апикальную мембрану участвует несколько переносчиков (транспортеры), работающих сопряженно (рис. 2). Переносчики ионов через биологические мембраны подразделяют на три типа: ионные насосы (на языке биохимиков - ионтранспортирующие АТФазы), ионообменники и каналы. Ионные насосы, или помпы (натриевый, кальциевый и протонный), переносят ионы через биологические мембраны против электрохимического градиента, используя энергию, запасенную в виде макроэргической связи в молекуле АТФ. Ионообменники обменивают один ион на другой, используя градиент концентраций одного из обмениваемых ионов, созданный ионными насосами или другими ферментными системами (Na+/H+-обменник, НСO3+/Сl--обменник, Na+/Ca2+-oбменник). Наконец, перенос ионов по градиенту концентраций осуществляют каналы, представляющие собой белковую пору в мембране, обладающую проводимостью для ионов определенного типа (Na+-, Ca2+- и Сl-канал), которая регулируется электрическим (потенциалозависимые каналы) или химическим (лигандозависимые каналы) путем. Наличие ионных переносчиков разного типа позволяет клетке очень тонко регулировать ионный гомеостаз.
Ионные переносчики всех трех типов участвуют в секреции соляной кислоты париетальными клетками. Основным элементом этой транспортной системы является протонный насос, обеспечивающий АТФ-зависимый обмен внутриклеточных Н+ на внеклеточные ионы К+ и локализованный в апикальной мембране париетальной клетки [6]. Оба иона (Н+ и К+) переносятся протонной помпой через мембрану против электрохимического градиента. Из клетки накапливающиеся ионы К+ выходят по градиенту концентраций, по-видимому, через специальный канал, причем выход этого катиона сопровождается выходом из клетки анионов О также по специальному каналу. Таким образом, суммарным результатом работы транспортной системы, локализованной в апикальной мембране клетки (протонной помпы, К+- и Сl- -каналов; см. рис.2), являются секреция соляной кислоты в люминальное пространство и циклическое перемещение ионов калия из клетки наружу и в обратном направлении.
Рис. 2. Париетальная клетка
Ионы Сl- попадают в клетку через базолатеральную мембрану. В транспорте этого аниона принимает участие НСO3/Сl - анионный обменник (см. рис.2). Необходимые для обмена ионы НСO3 образуются в клетке за счет работы фермента карбоангидразы, обеспечивающего синтез Н2СO3 из углекислого газа, который появляется в клетке в результате метаболических процессов, и воды. Н+, образующийся при диссоциации Н2СO3, секретируется протонным насосом в люминальное пространство. Карбоангидраза локализована в клетке в непосредственной близости от системы внутриклеточных канальцев. При интенсивной работе насоса, когда начинает ощущаться нехватка Н+ внутри клетки, включаются также встроенные в базолатеральную мембрану катионобменни-ки (К+/Н+ или Na+/H+), обменивающие внеклеточный Н+ на внутриклеточный К+ или Na+. Таким образом, присутствие дополнительных переносчиков, находящихся на базолатеральной мембране, обеспечивает трансэпителиальный транспорт анионов О и частично Н+.
Роль протонного насоса в системе, обеспечивающей секрецию соляной кислоты, выполняет Н+-,К+-АТФаза - фермент, относящийся к семейству АТФаз Р-типа [6]. Ближайшим родственником этого фермента является Na+-,К+-АТФаза, которая вместе с Н+-,К+-АТФазой образует отдельное подсемейство. Кроме эпителиальных клеток желудка, Н+-,К+-АТФаза (или ее изоформа) встречается также в эпителиальных клетках почечных канальцев и эпителии некоторых отделов кишечника. Как и Na+-,К+-АТФаза, Н+-,К+-АТФаза состоит из субъединиц двух типов: a-субъединицы - полипептида с молекулярной массой около 100 кДа (1033 аминокислотных остатка), выполняющего каталитическую функцию, b-субъединицы - гликопротеида с невыясненной до конца функцией, молекулярная масса которого составляет 50-60 кДа (291 аминокислотный остаток; остальная часть молекулы, примерно 1/3 по массе, представлена углеводными фрагментами). В настоящее время определена аминокислотная последовательность как а- [8], так b-субединиц [2], а также установлено расположение полипептидных цепей этих белков в мембране (рис. 3).
Рис. 3. Структура протонной помпы
протонный помпа желудочный слизистый
Полипептидная цепь a-субъединицы несколько раз пересекает мембрану, образуя 5 трансмембранных петель. N- и С-концы a-субъединицы находятся в цитоплазме. Значительная часть полипептидной цепи (около 800 аминокислот) образует большой цитоплазматический домен, в котором расположен активный центр фермента, где и происходит гидролиз АТФ. Катионы перемещаются через мембрану сквозь канал, который формируется трансмембранными петлями. N-конец b-субъединицы находится внутри цитоплазмы, ее полипептидная цепь пересекает мембрану только один раз. Большая часть b-субъединицы располагается с внеклеточной стороны мембраны. На ней расположены участки, подвергающиеся гликозилированию.
Протонный насос (Н+-,К+-АТФаза) осуществляет гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата. Высвобождающаяся в процессе гидролиза энергия используется для переноса катионов через мембрану против электрохимического градиента. В процессе каталитического цикла терминальная фосфорильная группа молекулы АТФ переносится на остаток аспарагиновой кислоты, расположенный на а-субъединице (Asp-385). В процессе гидролиза АТФ Н+-,К+-АТФаза пребывает в двух основных конформациях -- Е1 и Е2, которые различаются по сродству к переносимым катионам. Процесс фосфорилирования - дефосфорилирования фермента сопряжен с закрыванием - открыванием створок канала с цитоплазматической или люминальной стороны мембраны, а переход Е1-Е2 - с изменением сродства к переносимым катионам. Циклическое чередование двух основных конформаций, а также процесса фосфорилирования - дефосфорилирования обеспечивает перенос протонов и ионов калия против градиента.
Каталитический цикл Н+-,К+-АТФаза представлен на рис. 3, б. Конформация Е, имеет высокое сродство к Н+, а конформация Е2 - к катионам К+. В конформации Е1, с ионсвязывающими центрами a-субъединицы, расположенными на цитоплазматической поверхности мембраны, связывается Н+, после чего происходит фосфорилирование Asp-385, расположенного в активном центре фермента (образование формы Е1-Р). Вследствие фосфорилирования закрываются створки канала, находящиеся на цитоплазматической стороне мембраны. Затем протоны перемещаются через мембрану, что приводит к изменению конформации фермента (переход Е1-Р в Е2-Р). В этом состоянии открываются створки канала с люминальной (внеклеточной) стороны. После этого протоны высвобождаются из катионсвязывающих участков фермента, а ионы К+ связываются с катионсвязывающими центрами на люминальной поверхности мембраны. Связывание К+ с Е2-Р формой фермента активирует гидролиз ацилфосфатной связи и высвобождение неорганического фосфата. Вслед за этим происходит закрывание створок канала с внеклеточной стороны, и ионы калия с внеклеточной поверхности мембраны перемещаются на цитоплазматическую. Связывание АТФ приводит к тому, что фермент претерпевает изменение конформаций (из Е2 переходит в Е,), и ионы К+ высвобождаются в цитоплазму, после чего цикл может повториться. Обмен ионов Н+ на ионы К+, осуществляемый Н+-,К+-АТФазой, является электронейтральным. Создаваемая в результате работы протонного насоса разница в концентрации ионов Н+ по разные стороны апикальной мембраны составляет 106. Это самый большой градиент концентраций, создаваемый известными в настоящее время системами активного транспорта.
Активность Н+-,К+-АТФазы (протонная помпа) специфически подавляется омепразолом и другими соединениями (лансопразол, пантопразол), являющимися замещенными производными бензимидазола (рис. 4). Эти соединения, широко используемые для лечения кислотозависимых заболеваний желудка, представляют собой слабые основания.
Рис. 4. Ингибиторы протонного насоса
Накапливаясь в кислых компартментах клетки, главным образом во внутриклеточных канальцах париетальных клеток, они связывают Н+ и претерпевают внутримолекулярные перестройки, превращаясь в собственно ингибитор, который ковалентно (необратимо) взаимодействует с SH-группами белка, расположенными на люминальной поверхности апикальной мембраны [7]. Восстановление активности Н+-,К+-АТФазы после обработки омепразолом происходит главным образом по мере синтеза новых молекул фермента, поэтому длительность вызванного им ингибирования зависит от скорости обновления фермента (половина молекул Н+-,К+-АТФазы человека обновляется за 30-48 ч). Специфичность действия омепразола и родственных соединений зависит от двух факторов: во-первых, от того, что их превращение в ингибитор происходит только в кислой среде (т.е. собственно в желудке), а во-вторых, от того, что мишенью действия ингибитора являются SH-группы протонной помпы, которые экспонированы в люминальное пространство желудка. Таким образом, ингибитор доставляется прямо к месту его действия.
Кроме омепразола и его аналогов, известны и нековалентные (обратимые) ингибиторы Н+-,К+-АТФазы [5]. Среди них наиболее изучены имидазопиридин SCH-28080 и SK&F 96936 (см. рис. 4). Эти соединения взаимодействуют с К-связывающим участком фермента. Длительность их действия на Н+-,К+-АТФазу обусловлена временем жизни главным образом самого соединения, а не фермента. В настоящее время предпринимаются попытки на основе обратимых ингибиторов Н+-,К+-АТФазы создать новый класс фармакологических средств для лечения кислотозависимых заболеваний желудка.
Помимо Н+-,К+-АТФазы, в секреции соляной кислоты участвуют также компоненты, обеспечивающие транспорт ионов К+ по градиенту концентраций и сопряженного с ним выхода Cl- против градиента концентраций. Транспорт ионов Cl- осуществляется через хлорный канал, который идентифицирован [4]. Он представляет собой белок с молекулярной массой около 100 кДа (898 аминокислот) и по структуре похож на каналы семейства СlС-2+, которые присутствуют в мозге и сердце (гомология в первичной аминокислотной последовательности между хлорным каналом из слизистой оболочки желудка кролика и СlС-2 хлорным каналом из мозга крысы составляет 93%). Проводимость канала равна 7 pS при концентрации CsCl 150 мМ с обеих сторон мембраны. Через канал, кроме Cl-, могут проходить и другие анионы. Селективность канала для катионов уменьшается в ряду: I-, Сl-, Вr-, NO-. Канал является потенциал- и рН-зависимым. Изменение потенциала от 0 до -80 мВ приводит к 10-кратному увеличению проводимости канала. При потенциале -80 мВ и внутриклеточном рН 7,4 снижение рН вне клетки до 3,0 дополнительно увеличивает проводимость канала в 5-6 раз.
Ионы К+ покидают клетку, по-видимому, через специальный калиевый канал. Установлено, что секреция соляной кислоты тормозится тетраэтиламмонием, который известен как ингибитор калиевых каналов. Однако в отличие от Сl-канала, структура которого хорошо изучена, калиевый канал идентифицирован только в электрофизиологических экспериментах.
Для выяснения молекулярных механизмов, обеспечивающих активацию секреции соляной кислоты, необходимо определить последовательность процессов, происходящих после связывания молекулы секретогена с рецептором, расположенным на поверхности париетальной клетки. В течение многих лет было известно, что париетальная клетка содержит как минимум рецепторы двух типов: гистаминовые Н2-рецепторы и мускариновые рецепторы для ацетилхолина. До недавнего времени не было данных о рецепторе для гастрина. Считалось, что гастриновые рецепторы находятся на энтерохромаффинных клетках, которые после связывания гастрина высвобождают гистамин. Выделяющийся из этих клеток гистамин связывается с Н2-рецепторами париетальных клеток, обеспечивая стимуляцию секреции.
Однако недавно было установлено, что и париетальные клетки содержат гастриновые рецепторы [10]. Рецептор для гастрина относится к типу В-рецепторов для холецистокинина (ССК-В). Этот тип рецепторов, как и находящиеся на поверхности париетальных клеток М-рецепторы, обеспечивает свое действие, активируя фосфолипазу С (рис. 5). Этот фермент гидролизует фосфоинозитиды, находящиеся в липидном слое мембраны. По-видимому, образующийся в результате гидролиза инозитолтрифосфат вызывает выход Са2+ из внутриклеточных депо (эндоплазматический ретикулум), в результате чего концентрация Са2+ внутри клетки возрастает. Второй продукт этой реакции - диацилглицерол вместе с Са2+ активирует Са, фосфолипидозависимую протеинкиназу (протеинкиназа С), которая в свою очередь фосфорилирует белки мишени, влияя на их функциональную активность. Кроме того, при связывании гастрина и ацетилхолина с рецепторами, находящимися на поверхности париетальных клеток, внутриклеточный уровень цГМФ повышается, вызывая цГМФ-зависимое фосфорилирование белков.
Рис. 5. Схема активации париетальной клетки
Таким образом, в результате активации париетальных клеток под действием как гастрина, так и ацетилхолина могут происходить увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ и цГМФ и обусловленное этими агентами фосфорилирование белков-мишеней под действием протеинкиназ (см. рис. 5). Однако вся последовательность событий, от момента связывания гастрина и ацетилхолина с рецепторами до активации протонной помпы в отношении париетальной клетки, недостаточно изучена.