С учетом локализации днРНК LL35 в ядре в качестве альтернативного подхода к ингибированию днРНК LL35 были выбраны антисмысловые олигонуклеотиды (АСО). С использованием программного обеспечения ViennaRNA для дизайна АСО получена модель вторичной структуры днРНК LL35 (рис. 2В) [20]. Подобраны 14 антисмысловых оли-гонуклеотидов, комплементарных выступающим петлям в предсказанной структуре РНК. АСО 3, 4, 7, 8, 13 и 14 показали более высокую эффективность ингибирования днРНК LL35 (рис. 2Г), чем отдельные миРНК и их смесь. Использование смеси АСО № 1 позволило добиться снижения уровня экспрессии днРНК LL35 на 90% от исходного, поэтому эту смесь отобрали для дальнейшей работы (рис. 2Д).
Рисунок 2. днРНК LL35 участвует в регуляции транскрипционного фактора Foxa2 в гепатоцитах мыши AML12
Ранее анализ транскриптома эмбриональных стволовых клеток человека на стадии дифференци- ровки выявил корреляцию изменений экспрессии днРНК DEANR1 и мРНК транскрипционного фактора Foxa2. Предложен возможный механизм активации транскрипции мРНК фактора Foxa2 за счет привлечения модуляторов транскрипции Smad2/3, которые прямо взаимодействуют с DEANR1 [14]. При ингибировании функционального аналога DEANR1 - днРНК LL35 (рис. 3А) в гепатоцитах мыши уровень экспрессии мРНК фактора Foxa2 снижается на 20% от исходного уровня мРНК (рис. 3Б). Количество белка транскрипционного фактора Foxa2 снижается на 30% (рис. 3В, Г).
Рис. 3. А - эффективность ингибирования днРНК LL35 в гепатоцитах мыши AML12 смесью АСО № 1; Б - анализ количества мРНК транскрипционного фактора Foxa2 в условиях ингибирования днРНК LL35 методом ОТ-ПЦР-РВ (контроль - РНК Gapdh); B, Г - анализ количества белка транскрипционного фактора Foxa2 в условиях ингибирования днРНК LL35 методом Вестерн-блотинга (контроль - в-актин)
Фактор Foxa2 - важный регулятор дифференцировки энтодермы в различные типы тканей. Во взрослой печени Foxa2 действует как один из основных регуляторов транскрипции печень-специфичных генов, кодирующих ключевые участники липидного метаболизма и кетогенеза, он необходим для нормального функционирования органа [16]. Стоит также отметить важную роль Foxa2 в контроле процесса органогенеза печени [21]. В геноме днРНК DEANR1 человека и LL35 мыши расположены в непосредственной близости от гена транскрипционного фактора Foxa2. Был предложен механизм, посредством которого днРНК DEANR1 человека регулирует транскрипционный фактор Foxa2 в эмбриональных стволовых клетках [14]. Геномная локализация гена днРНК LL35 позволила предположить, что сходные функции выполняет и днРНК LL35, которая может участвовать в регуляции транскрипционного фактора Foxa2.
Согласно данным, представленным в базе NCBI, самое большое количество днРНК DEANR1 человека содержится в печени, на втором месте стоит желудок, потом легкие, поджелудочная железа, кишечник. Анализ количества потенциального функционального аналога DEANR1 - РНК LL35 в органах мыши выявил ее тканеспецифичную экспрессию в легких и печени, что несколько отличается от экспрессии РНК DEANR1 человека. Возможно, что существуют различия в функциях DEANR1 и LL35 в ряде органов, поэтому мы выбрали печень в качестве объекта дальнейшей работы, так как обе эти днРНК высоко представлены в печени.
Нами показано, что в гепатоцитах мыши днРНК LL35, как и днРНК DEANR1 человека, находится, в основном, в ядре. Оптимальным подходом к ингибированию и изучению функции днРНК, мишени которых локализованы в ядре, считается использование антисмысловых олигонуклеотидов, однако при активном транспорте ядро «цитоплазма могут использоваться и миРНК. миРНК обладают преимуществом при работе in vivo, так как они эффективны в меньших дозах и обеспечивают большую продолжительность подавления экспрессии мишеней, что позволяет минимизировать гепатотоксичность. После сравнения двух подходов мы остановились на АСО, которые с большей эффективностью подавляют экспрессию днРНК LL35. Однако использование одиночных АСО для подавления днРНК LL35 может приводить к сохранению функционально активной части днРНК. Для повышения вероятности инактивации функционального центра днРНК LL35 проверена эффективность ингибирования LL35 разными комбинациями АСО. С использованием данного подхода нам удалось добиться 90% ингибирования днРНК LL35 в гепатоцитах мыши. В условиях ингибирования днРНК в линии гепатоцитов мыши AML12 снижение мРНК Foxa2 составило 20%, а белка - 30%. Полученные данные хорошо согласуются с опубликованными данными об изменениях Foxa2 в клетках легких мыши в условиях эмбрионального нокаута гена днРНК LL35. Мы предполагаем аналогичный механизм регуляции транскрипционного фактора Foxa2 за счет привлечения белков Smad2/3 к промоторной области Foxa2, что приводит к активации транскрипции [14]. Также можно предположить, что во взрослой здоровой печени днРНК LL35 участвует в поддержании нормальной функции печени за счет регулирования активации Foxa2 и его мишеней в зависимости от внешних сигналов.
Функции днРНК и молекулярные механизмы изучают преимущественно in vitro, что не позволяет определить их роль в развитии различных заболеваний. Оптимальным подходом к решению этой проблемы является изучение функций днРНК in vivo. Ранее показали, что при фиброзе печени происходит подавление транскрипционного фактора Foxa2 с последующим стрессом эндоплазматического ретикулума, приводящего к гибели гепато- цитов [19, 22]. Количество Foxa2 снижается также при травмах печени различной этиологии [22]. Обнаруженное нами снижение количества днРНК LL35 в образцах печени с индуцированным фиброзом согласуется с опубликованными ранее данными о снижении количества мРНК транскрипционного фактора Foxa2, что также подтверждает существование регуляции. Более того, уровень экспрессии днРНК LL35 на второй и четвертой неделе после индукции фиброза согласуется с пролиферативной активностью гепатоцитов при регенерации печени при фибротических повреждениях [23].
На основании полученных нами и опубликованных ранее данных можно заключить, что днРНК LL35 в мыши является функциональным аналогом днРНК человека DEANR1. В представленной работе показана тканеспецифическая экспрессия днРНК LL35 в печени и легких. Определена их ядерная локализация в клетках печени и впервые показано эффективное ингибирование экспрессии днРНК LL35 с использованием АСО. Снижение уровня РНК LL35 приводит к уменьшению количества мРНК и белка фактора Foxa2 в клетках печени. Впервые установлено снижение количества днРНК LL35 в процессе фиброза печени, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения днРНК in vivo. Исходя из полученных результатов можно предположить, что днРНК LL35 вовлечена в молекулярные механизмы развития стресса эндоплазматического ретикулума гепатоцитов, возникающего при развитии фиброза печени. С другой стороны, днРНК LL35 может также участвовать в развитии фиброза за счет взаимодействия с модуляторами транскрипции Smad2/3 [14] в звездчатых клетках. Например, днРНК LFAR1 регулирует количество и степень фосфорилирования белков Smad2/3, что, в свою очередь, приводит к их транслокации в ядро и активации экспрессии ряда генов, в том числе участвующих в синтезе коллагена типа I [24]. Все эти гипотезы нуждаются в дальнейшей проверке, а возможность адресной доставки предложенных антисмысловых олигонуклеотидов в клетки печени in vivo позволяет изучать днРНК LL35 в различных мышиных моделях заболеваний печени [25].
Список литературы
1. Al-Tobasei R., Paneru B., Salem M. // PLoS One. 2016. V. 11. № 2. P. e0148940.
2. Long Y., Wang X., Youmans D.T., Cech T.R. // Sci. Adv. 2017. V. 3. № 9. P eaao2110.
3. Dykes I.M., Emanueli C. // Genom. Proteom. Bioinf. 2017. V. 15. № 3. P 177-186.
4. Tripathi V., Ellis J.D., Shen Z., Song D.Y., Pan Q., Watt A.T., Freier S.M., Bennett C.F., Sharma A., Bubulya P.A., et al. // Mol. Cell. 2010. V. 39. № 6. P. 925-938.
5. Militello G., Weirick T., John D., Dцring C., Dimmeler S., Uchida S. // Brief. Bioinform. 2017. V. 18. № 5. P. 780-788.
6. Smekalova E.M., Kotelevtsev Y.V., Leboeuf D., Shcherbinina E.Y., Fefilova A.S., Zatsepin T.S., Koteliansky V. // Biochimie. V. 131. P 159-172.
7. Wang Y., Xue K., Guan Y., Jin Y., Liu S., Wang Y., Liu S., Wang , Han L. // Oncol. Res. 2017. V. 25. № 5. P 733-742.
8. Zhang H.-F., Li W., Han Y.-D. // Cancer Biomark. Sect. Dis. Markers. 2018. V. 21. № 3. P. 575-582.
9. Wang Y., Xue K., Guan Y., Jin Y., Liu S., Wang Y., Liu S., Wang L., Han L. // Oncol. Res. 2017. V. 25. № 5. P 733-742.
10. Fan Y., Wang Y.-F., Su H.-F., Fang N., Zou C., Li W.-F., Fei Z.-// J. Hematol. Oncol. 2016. V. 9. № 1. P 57-72.
11. Mьller S., Raulefs S., Bruns P., Afonso-Grunz F., Plцtner A., Thermann R., Jдger C., Schlitter A.M., Kong B., Regel I., et al. // Mol. Cancer. 2015. V. 14. P. 94-112.
12. Wang Z.K., Yang L., Wu L.L., Mao H., Zhou Y.H., Zhang P.F., Dai G.H. // Braz. J. Med. Biol. Res. 2017. V. 51. № 2. P. e6793.
13. Liu Y., Xiao N., Xu S.-F. // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. V. 21. № 24. P 5691-5695.
14. Jiang W., Liu Y., Liu R., Zhang K., Zhang Y. // Cell Rep. 2015. V. 11. № 1. P. 137-148.
15. Lee C.S., Friedman J.R., Fulmer J.T., Kaestner K.H. // Nature. 2005. V. 435. № 7044. P. 944-947.
16. Wolfrum C., Asilmaz E., Luca E., Friedman J.M., Stoffel M. // Nature. 2004. V. 432. № 7020. P. 1027-1032.
17. Herriges M.J., Swarr D.T., Morley M.P., Rathi K.S., Peng T., Stewart K.M., Morrisey E.E. // Genes Dev. 2014. V. 28. № 12. P. 1363-1379.
18. Swarr D.T., Herriges M., Li S., Morley M., Fernandes S., Sridharan A., Zhou S., Garcia B.A., Stewart K., Morrisey E.E. // Genes. Dev. 2019. V. 33. № 11-12. P 656-668.
19. Wang W., Yao L.-J., Shen W., Ding K., Shi P.-M., Chen F., He J., Ding J., Zhang X., Xie W.-F. // Sci. Rep. 2017. V. 7. № 1. P. 15532-15547.
20. Lorenz R., Bernhart S.H., Hцner zu Siederdissen C., Tafer H., Flamm C., Stadler P.F., Hofacker I.L. // Algorithms Mol. Biol. V. 6. P 26-40.
21. Lee C.S., Friedman J.R., Fulmer J.T., Kaestner K.H. // Nature. 2005. V. 435. № 7044. P. 944-947.
22. Wang K. // Cell. Signal. 2015. V. 27. № 4. P. 729-738.
23. Koyama Y., Brenner D.A. // J. Clin. Invest. 2017. V. 127. № 1. P. 55-64.
24. Peng H., Wan L.-Y., Liang J., Zhang Y.-Q., Ai W.-B., Wu J.-F. // Cell Biosci. 2018. V. 8. P 63-71.
25. Crooke S.T., Witztum J.L., Bennett C.F., Baker B.F. // Cell Metab. 2018. V. 27. № 4. P. 714-739.