Статья: Длинная некодирующая РНК LL35/Falcor - регулятор экспрессии транскрипционного фактора Foxa2 в гепатоцитах нормальной ткани печени мыши и при фибротических изменениях

Длинная некодирующая РНК LL35/Falcor - регулятор экспрессии транскрипционного фактора Foxa2 в гепатоцитах нормальной ткани печени мыши и при фибротических изменениях

О.В. Сергеева¹*, С. А. Коринфская¹, И. И. Курочкин¹, Т. С. Зацепин^1,2

1 Сколковский институт науки и технологий, Центр наук о жизни,

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Реферат

Длинные некодирующие РНК (днРНК) играют важную роль в регуляции транскрипции, сплайсинга, трансляции и других процессов в клетке. Ранее у человека и мыши были обнаружены днРНК (DEANR1 и LL35/Falcor соответственно), расположенные в геномном окружении в непосредственной близости от транскрипционного фактора Foxa2. В данной работе показана тканеспецифическая экспрессия днРНК LL35/Falcor в печени и легких мыши. Применение антисмысловых олигонуклеотидов позволило на 90% подавить экспрессию днРНК LL35/Falcor. При этом уменьшилось количество мРНК и белка Foxa2, что подтверждает участие днРНК LL35/Falcor в регуляции фактора транскрипции Foxa2. Нами показано снижение экспрессии днРНК LL35 при фиброзе печени, что коррелирует с выявленным ранее уменьшением количества мРНК фактора Foxa2. Таким образом, днРНК LL35 регулирует экспрессию Foxa2 в печени не только в норме, но и при фиброзе, что позволяет рассматривать эту днРНК в качестве биомаркера этого патологического процесса.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА некодирующие РНК, печень, транскрипционный фактор Foxa2.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ днРНК - длинная некодирующая РНК; миРНК - малая интерферирующая РНК; АСО - антисмысловой олигонуклеотид.

Анализ транскриптома человека показал, что менее 2% генома кодирует белки, а среди остальных 98% превалируют гены некодирующих РНК. Среди множества некодирующих РНК можно выделить короткие (меньше 200 нуклеотидов) и длинные РНК (больше 200 нуклеотидов) [1]. Длинные некодирующие РНК (днРНК) выполняют регуляторные функции во всех основных клеточных процессах. Они участвуют в регуляции транскрипции локально (in cis) и дистанционно (in trans), воздействуя на такие регуляторные элементы, как промоторы и энхансеры, а также на структуру хроматина и активность РНК-полимеразы [2]. днРНК могут участвовать в регуляции трансляции [3] и альтернативного сплайсинга за счет привлечения белковых факторов [4], а также служить «молекулярными ловушками» для миРНК и регулировать их количество в свободном виде в клетке [5]. днРНК не только выполняют регуляторную функцию в клетке, часто они экспрессируются тканеспецифически и/или транскрибируются только в определенных условиях. Увеличение транскрипции ряда днРНК, таких, как MALAT-1, HOTAIR, H19 и HULC, стимулирует развитие онкологических заболеваний [6].

С каждым годом растет количество известных функционально важных длинных некодирующих РНК, однако механизмы действия большинства из них остаются неизвестными. Несмотря на то, что работа с клеточными культурами позволяет исследовать молекулярные механизмы действия днРНК, использование животных моделей обеспечивает более общий и корректный подход к изучению функций днРНК. Однако низкая гомология днРНК даже у близких видов затрудняет подобные исследования, а в ряде случаев гомология наблюдается только на уровне вторичной структуры. Поиск функциональных аналогов человеческих днРНК у мышей также позволяет расширить возможности изучения днРНК за счет использования различных мышиных моделей заболеваний.

Ранее было показано, что днРНК DEANR1 человека участвует в регуляции пролиферации, способствует апоптозу клеток хориокарциномы [7], влияет на сигнальный путь Notch [8] и служит потенциальным биомаркером ряда онкологических заболеваний, таких, как хориокарцинома [9], рак желудка [10], поджелудочной железы [11] и толстой кишки [12], нескольких типов рака легких [13]. Ген днРНК DEANR1 расположен в непосредственной близости от гена транскрипционного фактора Foxa2 в геноме человека. днРНК DEANR1 участвует в регуляции Foxa2 в процессе дифференцировки клеток энтодермы поджелудочной железы человека [14]. Предложен механизм активации транскрипции гена Foxa2 путем привлечения белков Smad2/3 к его промотору. Foxa2 необходим для развития печени из энтодермы [15] и является транскрипционным активатором печень- специфических генов - альбумина и трансферрина, а также играет важную роль в гомеостазе глюкозы в печени [16]. При анализе геномного окружения Foxa2 в геноме мыши был обнаружен потенциальный функциональный аналог днРНК DEANR1 - днРНК LL35/Falcor (далее LL35) [17]. Делеция гена, кодирующего днРНК LL35, приводит к снижению уровня мРНК транскрипционного фактора Foxa2 на 25-30% в эпителии легких мыши и не приводит к явному фенотипу при развитии легких эмбриона. Однако LL35 играет важную роль в регулировании Foxa2 в ответ на дополнительные воздействия, такие, как повреждение легких [18]. В рамках данной работы нами охарактеризована днРНК LL35: определена тканеспецифическая экспрессия в органах мыши, показана внутриклеточная локализация, проведено сравнение различных подходов к ингибированию днРНК, впервые получен нокдаун днРНК LL35, показано участие в регуляции транскрипционного фактора Foxa2 в клетках печени мыши. Также впервые выявлено уменьшение количества днРНК при фиброзе печени.

Экспериментальная часть

Клеточные линии

Гепатоциты мыши AML12 (АТСС, США) культивировали в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, при 37°С и 5% СО2.

Выделение ядерных и цитоплазматических клеточных экстрактов

Клетки AML12 (~1 X 10⁶), выращенные в стандартных условиях, снимали с подложки 0.25% раствором трипсина в 0.5 мМ EDTA, промывали фосфатным буфером (10 мМ фосфата натрия, 100 мМ хлорида натрия, рН 7.4) и осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 500 g. Осадок ресуспендиро- вали в буфере CE (20 мМ HEPES (pH 7.4), 1.5 мМ MgCl₂, 10% глицерин, 0.05% NP-40), содержащем ингибиторы протеаз. После чего суспензию инкубировали на льду в течение 10 мин и центрифугировали при 1700 g в течение 5 мин при 4°C. Фракция супернатанта является цитоплазматическим клеточным экстрактом. Осадок ресуспендировали в буфере NE (20 мМ HEPES (pH 7.4), 1.5 мМ MgCl₂, 10% глицерин, 0.05% NP-40, 500 мМ NaCl), содержащем ингибиторы протеаз. После чего суспензию инкубировали на льду в течение 10 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 1700 g при охлаждении до 4°C. Фракция супернатанта является ядерным клеточным экстрактом. Суммарную РНК из разделенных экстрактов выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) по методике производителя. клетка цитоплазматический ген некодирующий

Анализ транскрипции генов

Суммарную РНК из органов мыши или клеток AML12 выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) по методике производителя. Далее ~1 мкг суммарной РНК обрабатывали ДНКазой I (Thermo Scientific, США) по методике производителя для удаления остатков геномной ДНК и проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора реагентов Maxima First Strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific, США). Реакционную смесь разбавляли в 3 раза водой и проводили реакцию амплификации в режиме реального времени (ОТ-ПЦР) с использованием набора реагентов PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, США) по методике производителя (0.3 мкМ смеси праймеров, 0.2 мкг кДНК). Для амплификации днРНК LL35 были выбраны два набора праймеров, которые в дальнейшем использовали во всех экспериментах (таблица). Продукты реакции анализировали методом гель- электрофореза в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере

Таблица 1 Нуклеотидные последовательности праймеров для ОТ-ПЦР, миРНК и АСО

Примечание. Заглавными буквами обозначены рибонуклеотиды, заглавными курсивом - 2'-дезоксинуклеоти- ды, строчными - 2'-0-метилрибонуклеотиды, s - тиофосфатные группы. (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ EDTA, pH 7.6). При проведении ОТ-ПЦР разделенных клеточных фракций количество целевой РНК в ядерной фракции нормировали по количеству U2 мяРНК, а количество целевой РНК в цитоплазматической фракции - по мРНК Gapdh.

Трансфекция клеток AML12 миРНК и антисмысловыми олигонуклеотидами миРНК и антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) (таблица) были синтезированы по амидофосфит- ной схеме, очищены методом ион-обменной хроматографии, а их чистоту подтверждали методом ВЭЖХ-МС. Клетки AML12 (~1 х 10⁵) трансфицировали миРНК или АСО в концентрации 10 и 5 нМ соответственно, используя реагент Lipofectamine- RNAiMAX (Invitrogen) по протоколу производителя. В качестве контроля использовали миРНК и АСО к гену люциферазы (таблица). Для получения смесей миРНК и АСО проводили эквимолярное смешивание. миРНК: № 1 1 + 2 + 3+6; № 2 1 + 3+2; № 3 1 + 3+6; № 4 1 + 3+6; № 5 2 + 3+6. АСО: № 1 3+4+7 + 8+14; № 2 3+7+14; № 3 3+4+14; № 4 3+14. Суммарную РНК выделяли через 24 ч после трансфекции с использованием реагента Trizol (Invitrogen, США) по методике производителя, эффективности ингибирования анализировали методом ОТ-ПЦР.

Вестерн-блотинг

Клетки AML12 (~1х10⁶) лизировали в буфере RIPA (Thermo Scientific, США), содержащем 1 мМ ДТТ, 0.05% Тритон Х-100, 0.2 мМ фенилметилсульфо- нилфторида, ингибиторы протеаз и фосфатаз. Концентрацию белков в лизатах определяли методом спектрофотометрии с использованием реактива Брэдфорда (Thermo Scientific, США). Для дальнейшего анализа использовали лизат, содержащий 40 мкг белка, который предварительно денатурировали при 95°С в течение 5 мин. Белки разделяли методом гель-электрофореза в 10% ПААГ в присутствии трис-глицинового буфера (pH 8.3), после чего переносили на мембрану PVDF (Millipore) при напряжении 70 В в течение 1 ч. Далее мембрану инкубировали в течение 1 ч с 5% раствором БСА, а затем с раствором специфических антител. Использовали антитела против белков Foxa2 (ab108422 Abcam, США), актина (ab179467 Abcam, США), конъюгаты пероксидазы хрена с антителами к иммуноглобулинам кролика и мыши (ab6721 и ab6728 Abcam, США). Вторичные антитела визуализировали на мембранах методом хемилюминесценции c использованием набора Pierce ECL (Thermo Scientific, США) по методике производителя.

Статистический анализ экспериментальных данных

Для построения диаграмм в работе были использованы результаты шести независимых экспериментов. Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6.0) с использованием двухвыборочного t-критерия, а также двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA или дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями и t-теста Сидака. Данные считали статистически значимыми при P < 0.05.

Предсказание вторичной структуры днРНК LL35

Для определения возможной вторичной структуры днРНК LL35 использовали программу ViennaRNA (http://rna.tbi.univie.ac.at/), позволяющую предсказывать вторичные структуры РНК, обладающие минимальной свободной энергией и учитывающей вероятности образования пар оснований для РНК.

Определение уровня экспрессии днРНК LL35 в органах мыши и в клетках печени AML12

Согласно данным базы NCBI, ген днРНК LL35 (9020622O22Rik) располагается на расстоянии 2500 нуклеотидов от гена транскрипционного фактора Foxa2 и кодирует 38 аннотированных транскриптов, большая часть которых имеет общие экзоны (первый и два последних) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/?term=9030622O22Rik). Анализ уровня экспрессии экзонов, общих для всех транскриптов, использован для определения количества днРНК LL35 в органах мыши. Показана тканевая специфичность экспрессии и наибольшая представленность днРНК LL35 в легких и печени (рис. 1А). Для определения локализации днРНК LL35 в клетках AML12 нормальной печени были выделены ядерные и цитоплазматические экстракты с дальнейшим их анализом методом ОТ-ПЦР. Установлено, что днРНК LL35 находится преимущественно в ядре клетки - только ~20% общего количества РНК локализовано в цитоплазме (рис. 1Б). При этом количество РНК LL35 в ядре всего в 1.3 раза меньше количества мяРНК U2, что свидетельствует об уровне транскрипции, высоком для днРНК (рис. 1В).

Ранее было показано, что уровень мРНК транскрипционного фактора Foxa2 снижается при фиброзе печени, а делеция этого фактора предрасполагает к развитию фиброза [19]. Нами выявлено снижение количества днРНК LL35 до 30% от исходного уровня в образцах печени мыши с фиброзом, индуцированным тетрахлоридом углерода, через 2 недели после индукции фиброза, а затем уровень днРНК частично восстанавливается - до 60% к 4 неделям после ин-

Рис. 1. Л - определение количества днРНК LL35 в органах мыши (контроль - мРНК Gapdh); Б - определение локализации днРНК LL35 в гепатоцитах AML12 (контроль - РНК U2 для ядерной клеточной фракции, мРНК Gapdh - для цитоплазматической); Я - сравнение уровня экспрессии днРНК LL35 в ядерной и цитоплазматической фракциях гепатоцитов мыши AML12 с контрольными РНК U2 и Gapdh соответственно; Г - количество днРНК LL35 в образцах печени мыши с индуцированным фиброзом, полученных на второй и четвертой неделе после окончания воздействия тетрахлорида углерода (контроль - мРНК Gapdh)

Подбор условий ингибирования днРНК LL35 в клетках AML12

На первом этапе работы для ингибирования РНК LL35 in vitro мы использовали метод РНК-интер- ференции. Была проанализирована последовательность РНК LL35 и исключены возможные участки связывания миРНК, а также последовательности, встречающиеся в других РНК транс- криптома мыши. После чего был проведен дизайн и синтез 10 миРНК, специфичных к РНК LL35, содержащих 2'-0-метильные пиримидиновые нуклеотиды и тиофосфатные группы для увеличения стабильности к действию внутриклеточных нуклеаз. Эффективность ингибирования LL35 отдельнымимиРНК не превышала 40% (рис. 2А). С целью улучшения эффективности ингибирования были проверены наборы смесей миРНК (три-четыре миРНК в смеси). В данном случае ингибирование составило примерно 60% от исходного уровня РНК LL35 (рис. 2Б). Одним из объяснений такой невысокой эффективности миРНК может служить преимущественно ядерная локализация днРНК LL35 и отсутствие активного транспорта ядро «цитоплазма.