Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы головного мозга и сердца после хирургической овариэктомии (экспериментальное исследование)
14.03.06- фармакология, клиническая фармакология
Файзуллина Гульнара Исламовна
Уфа - 2010
Работа выполнена на кафедре фармакологии №2 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Валеева Лилия Анваровна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ларионов Леонид Петрович
доктор медицинских наук, профессор Зарудий Феликс Срульевич
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из важнейших задач фармакологии является повышение эффективности и безопасности лекарственных средств, в том числе и препаратов женских половых гормонов, которые применяются для заместительной гормональной терапии в период менопаузы и после хирургической овариэктомии. В последние годы отмечен рост гинекологических операций и «омоложение» контингента оперируемых женщин. Овариэктомия, проведенная в детородном возрасте, сопровождается необратимой утратой репродуктивной функции, изменениями в нейроэндокринной системе. Резко возникающий дефицит половых гормонов способствует возникновению системных изменений в органах и тканях.
До наступления менопаузы у женщин в 3 раза реже встречаются заболевания коронарных артерий, чем у мужчин. После наступления менопаузы частота сердечно-сосудистых заболеваний становится у них одинаковой, а еще позднее женщины даже опережают мужчин. Течение ИБС и структура осложнений этого заболевания у женщин имеет ряд особенностей. Так по данным Доценко, Ю.В., у женщин инфаркт миокарда чаще бывает безболевым либо отмечаются атипичные его симптомы, что нередко затрудняет диагностику. Женщины после инфаркта миокарда чаще страдают психическими расстройствами, хуже поддаются реабилитации, у них позже восстанавливается трудоспособность. Поэтому после овариэктомии и в период менопаузы показана гормонозаместительная терапия. Существует целый ряд высокоэффективных препаратов женских половых гормонов. Наиболее широкое распространение получили комбинированные препараты, в состав которых входят эстрогены и гестагены. Одним из таких препаратов является фемостон-10 («Solvay Pharma), содержащий микронизированный 17в-эстрадиол и дидрогестерон. Однако в нашей стране заместительную гормональную терапию принимают лишь менее 4% женщин с овариэктомическим синдромом. Это обусловлено наличием противопоказаний и повышением риска тромботических, онкологических, сердечно-сосудистых осложнений [Аккер Л.В., 2004]. Все это определяет необходимость поиска новых направлений коррекции постовариэктомического синдрома, исследования молекулярных механизмов действия женских половых гормонов.
Одним из важнейших нейромедиаторов организма является серотонин, который оказывает свое действие, связываясь с 7 типами и не менее 15 подтипами серотониновых рецепторов, присутствующих во всех органах и тканях [Сергеев П.В., 1999].
Серотонин, связываясь с серотониновыми рецепторами сердца и сосудов определяет тонус сосудов, влияет на коронарный кровоток, сердечный ритм, а взаимодействуя с рецепторами мозга, участвует в формировании настроения, полового, пищевого поведения, восприятии боли, когнитивных функций, регуляции цикла сон-бодрствование. Нарушения в серотонинергической системе приводят к возникновению аритмий сердца, нарушений сосудистого тонуса, тромботических нарушений, депрессии, психозов ожирения, мигрени, нарушений мозгового кровообращения, диссомнии [Попова Н.К., 2005, Сергеев П.В., 1999, Bardin L., 2001, Egashira N., 2002].
Однако влияние препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы в период менопаузы и после удалении яичников изучены недостаточно.
Цель исследования. Определить характер действия фемостона и его компонентов на серотониновые рецепторы сердца и мозга крыс после хирургической овариэктомии и при экспериментальном инфаркте миокарда.
Задачи исследования:
1. Определить уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с мембранной фракцией гомогената сердца (МФГС) при вытеснении креатинин-серотонином, 5-НТ1-агонистом - суматриптаном и 5-НТ3-антагонистом-ондансетроном у крыс после ложной и истинной овариэктомии в сравнении.
2. Оценить влияние 17в-эстрадиола, дидрогестерона и фемостона на уровень специфического связывания меченного лиганда с МФГС овариэктомированных крыс.
3. Определить количество сайтов связывания [3Н]-серотонина в сердце ложновариэктомированных и овариэктомированных крыс в разные сроки экспериментального инфаркта миокарда и после введения препаратов женских половых гормонов.
4. Изучить динамику уровня специфического связывания [3Н]-серотонина с мембранными фракциями гомогенатов мозга (МФГМ) при вытеснении креатинин-серотонином, суматриптпном и ондансетроном у самок крыс после ложной и истинной овариэктомии.
5. Определить уровень специфического связывания [3Н]-серотонина с МФГМ у овариэктомированных крыс на фоне заместительной терапии препаратами женских половых стероидов.
6. Изучить динамику специфического связывания [3Н]-серотонина с серотониновыми рецепторами головного мозга ложноовариэктомированных и овариэктомированных крыс в разные сроки после экспериментального инфаркта миокарда и после введения препаратов женских половых гормонов.
Научная новизна. Изучено специфическое связывание [3Н]-серотонина с МФГС и МФГМ при вытеснении лигандом серотониновых рецепторов серотонин-креатинином, 5НТ1-агонистом - суматриптаном, 5НТ3-антагонистом - ондансетроном у крыс с ложной и истинной овариэктомией. Установлено, что после ложной и истинной овариэктомии общее количество мест связывания [3Н]-серотонина и число 5НТ3-рецепторов в сердце и головном мозге самок крыс увеличивается, а количество 5НТ1-рецепторов уменьшается. Выявлено модулирующее действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы мозга и сердца у овариэктомированных самок. Исследовано состояние серотонинергической системы головного мозга и сердца у ложнооперированных и овариэктомированных крыс в разные сроки инфаркта миокарда. Установлено модулирующее действие 17в-эстрадиола, дидрогестерона и фемостона на серотониновые рецепторы сердца и мозга у кастрированных животных после инфаркта миокарда.
Научно-практическая значимость. Получены новые сведения о влиянии истинной и ложной овариэктомии, экспериментального инфаркта миокарда на серотониновые рецепторы сердца и головного мозга. Полученные данные расширяют представление о роли серотониновых рецепторов в регуляции деятельности сердца и головного мозга в норме и патологии, обосновывают возможность применения средств, действующих на серотонинергические синапсы, для фармакологической регуляции деятельности сердца и мозга в период менопаузы.
Выявлено модулирующее действие препаратов женских половых гормонов на серотониновые рецепторы сердца и головного мозга после хирургической овариэктомии, экспериментального инфаркта миокарда на фоне хирургической менопаузы, что вносит вклад в теоретическую фармакологию, раскрывая неизвестные аспекты механизма их действия.
Полученные данные могут быть использованы для преподавания фармакологии, кардиологии и гинекологии.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Ложная и истинная овариэктомии увеличивают количество мест связывания серотонина в сердце и мозге крыс, увеличивают количество 5-НТ3-рецепторов и уменьшают количество 5-НТ1-рецепторов.
2. Препараты женских половых гормонов оказывают модулирующее действие на серотониновые рецепторы сердца и головного мозга кастрированных самок с неоднозначным влиянием на различные подтипы рецепторов.
3. При экспериментальном инфаркте миокарда у крыс-самок изменяется уровень специфического связывание [3Н]-серотонина с МФГС и МФГМ. Динамика уровня связывания [3Н]-серотонина отличается у ложнооперированных и овариэктомированных крыс.
4. Препараты женских половых гормонов модулируют уровень специфического связывание [3Н]-серотонина с МФГС и МФГМ при экспериментальном инфаркте миокарда.
Внедрение результатов работы в практику. Полученные данные используются в учебном процессе на кафедрах фармакологии № 1 и № 2 Башкирского государственного медицинского университета. По результатам исследований зарегистрирован патент РФ № 2009138813/14 с приоритетом от 20.10.2009 г. «Средство для модуляции серотониновых рецепторов мозга при посткастрационном синдроме».
Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 1 публикация в журнале, рекомендуемом ВАК.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая-9 июня, 2004., 69-й республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины», Уфа, 2004, 71-й республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины», Уфа, 2006
Апробация работы состоялась на межкафедральном заседании кафедр фармакологии № 1 с курсом клинической фармакологии, фармакологии № 2 и ЦНИЛ ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» в декабре 2009 г.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного набора текста, состоит из введения, обзора литературы, глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа иллюстрирована 48 рисунками. Библиогафия представлена 56 отечественными и 161 иностранными источниками.
Материалы и методы исследования
Опыты проводили на 500 беспородных крысах-самках массой 140-160 г, содержавшихся в обычных условиях вивария.
Овариэктомию у крыс вызывали путем кастрации под легким эфирным наркозом. Для контроля за эффективностью кастрации у группы крыс в течение 3-х недель ежедневно брали влагалищные мазки (Киршенблат Я. Д., 1989). В качестве контроля были использованы самки, подвергшиеся ложной овариэктомии (разрез, извлечение придатков матки с последующим погружением, швы на мышцы и кожу).
Инфаркт миокарда у крыс вызывали путем перевязки передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на 1,5 мм ниже ушка левого предсердия под эфирным наркозом (Коган А. Х., 1979). Для подтверждения ИМ у животных регистрировали ЭКГ в трех стандартных отведениях при скорости движения бумажной ленты 50 мм/с, 1 мВ - 10 мм до начала экспериментов, сразу после воспроизведения ИМ и в динамике. Измерение размеров зоны некроза миокарда после коронароокклюзии производили макрогистохимически по методике Коган А. Х. (Коган А. Х., 1984). Контрольных животных оперировали аналогичным способом, но коронарную артерию не перевязывали, а лишь подводили под нее лигатуру.
Препараты вводились per os с первого дня овариэктомии, ежедневно, в течение 2-х недель. 17в-эстрадиол в дозе 20 мкг/сутки, дидрогестерон 100 мкг/сутки, фемостон в тех же дозах [Femoston, Dufaston, Solvay Farmaceuticals]. Животные, использованные в качестве контроля, получали плацебо по той же схеме.
Животных забивали путем декапитации под легким эфирным наркозом. Выделяли сердце и головной мозг, гомогенезировали, выделяли мембранную фракцию гомогената сердца и мозга путем дифференциального ультрацентрифугирования. Все манипуляции проводились быстро, строго на холоде. Серотониновые рецепторы определяли радиолигандным методом. Связывание [3H]-cеротонина было проведено методами K. B. Asarch, T. M. Shin (1987) и M. W. Hamblin et al. (1987). Для определения уровня общего связывания [3H]-серотонина мембранный препарат с конечным содержанием белка 0,3 - 1 мг/ мл инкубировали в триплете с [3H]-серотонином в концентрации 6 нМ. Неспецифическое связывание определяли точно также, но в присутствии 1000-кратного избытка немеченных лигандов (креатинин-серотонина - для определения общего количества серотонина, 5-НТ1-агониста - суматриптана - для определения количества 5-НТ1-рецепторов, 5-НТ3-антагониста - ондансетрона - для определения количества 5-НТ3-рецепторов). Реакция была остановлена путем фильтрации проб через фильтры GFC. Фильтры просушивались и помещались во флаконы с 5 мл сцинтиляционной жидкости на основе диоксана. Специфическое связывание вычисляли как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Содержание мест связывания выражали в фемтомолях лиганда, связавшегося с 1 мг белка. Белок определяли по Лоури (Lowry et al., 1951).
Статистическую обработку полученных результатов проводили c помощью пакета программ STATISTICA 6.0. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (М±SE).
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что ложная овариэктомия оказывает влияние на уровень специфического связывания [3H]-серотонина с МФГС. Через 7 и 14 суток общее количество серотониновых рецепторов повышалась более чем в 3 раза по сравнению с интактными животными, число 5-НТ1-рецепторов уменьшилась через 1 неделю на 50%, а через 2 недели - в 4 раза, количество 5-НТ3-рецепторов увеличилось через неделю более чем в 10 раз, а через 2 недели возвратилось к исходному уровню (рис. 1).
* - достоверно по сравнению с интактными крысами (р < 0,05). (М±m) из 10 опытов
Рис. 1. Уровень специфического связывания [3H]-серотонина при вытеснении серотонин-креатинином, суматриптаном и ондансетроном с МФГС у крыс после ложной (2 недели) и хирургической овариэктомии (2 недели).