Материал: Биоорганика вопросы

БИОХИМИЯ БИЛЕТЫ #1-5 (белки)

1. Генетически-кодируемые ак: структура и свойства

АК — мономеры белков. Алифатические и ароматические. Буква — близость атома с аминогруппой к атому с карбоксильной группой.

Главные 20 АК: 9 с гидрофобными R (Gly-G, Ala-A, Val-V, Leu-L, Ile-I, Met-M, Phe-F, Trp-W, Pro-P), 6 с полярными, но не заряженными (Ser-S, Thr-T, Cys-C, Tyr-Y, Asn-N, Gln-Q), 5 с заряженными (Asp-D, Glu-E, Lys-K, Arg-R, His-H).

Структура: H₂N — CH — C = O

| |

R OH

Свойства:

— чем меньше боковой радикал, тем свободнее вращение вокруг ковалентной связи альфа-С, тем выше подвижность фрагмента белка;

— старт синтеза всегда с кодона AUG (Met);

— стоп-кодоны: UAA, AUG, UGA;

— гидрофильность/гидрофобность;

— поглощение УФ (280 нм): Phe, Tyr, Trp;

— цистеин — способность окисляться с образованием дисульфидных мостиков S-S;

— амфотерны — сложное поведение в КО-реакциях из-за близости ионизируемых ФГ противоположного характера — основной аминогруппы и кислотной карбоксильной;

— ионное строение молекул: высокая температура плавления (200-300), нелетучесть, растворимость в воде и нерастворимость в неполярных органических растворителях;

— оптически активны: луч плоскополяризованного света, проходя через растворы, поворачивается на угол вправо или влево. Угол Ф пропорционален концентрации раствора с, толщине его слоя (ширине кюветы) d. Коэффициент пропорциональности — удельное вращение a, которое зависит от природы АК, длины волны света, значения pH и температуры: Ф = [a]*c*d;

— способность соединяться в длинные цепи через образование пептидной связи (поликонденсация АК с выделением воды).

2. Пептидная связь. Первичная, вторичная, третичная структуры белка. Принципы упаковки белковой молекулы. Типы химических связей.

Вид амидной связи, сопряжение свободной пары электронов у атома азота и π-электронов карбонильной группы. Аминогруппа теряет электронно-донорную способность, связь C-N "полуторная" (частично двойной характер), вращение вокруг нее затруднено. Лежит в одной плоскости (планарна). Радикалы могут находиться только под определенными углами.

Первичная структура белка — АК состав полипептида и порядок АК. Изображают от N-конца к C-концу.

Вторичная структура белка — пространственная организация небольшого участка полипептидной цепи: α-спираль или β-листы (антипараллельный, параллельный = складчатый). Стабилизируется водородными связями, образуемыми атомами из пептидной связи. Боковые радикалы участия не принимают.

— α-спираль — правозакрученная, 3,6 АК остатка. Некоторые АК дестабилизируют спирали (S, I, T, Y, D, K, R, G) — либо заряженный и поляризованный радикал, либо громоздкий или подвижный;

— β-лист — более стабильны антипараллельные, потому что водородные связи почти перпендикулярны пептидным и короче.

— β-поворот — на участках с пролином (и глицином), потому что у пролина в радикале жесткий пятичленный цикл с зафиксированными углами между атомами углерода. Подвижный глицин пристраивается к пролину и фиксирует его. Поворот на 180 градусов.

Дополнительные структуры (супервторичные): меандры (повторяющиеся бетаслои), бета-альфа-бета мотивы, греческий ключ (4 бета-слоя).

Третичная структура — пространственное расположение элементов вторичной структуры относительно друг друга. Белковая молекула в растворе испытывает на себе воздействия среды (электростатика, броуновское движение, архимедова сила, сила тяжести, трение), и все направлено на то, чтобы энергия молекулы была минимальной. Ключевая роль — взаимодействия функциональных групп боковых радикалов АК; определяет биологическую активность.

Четвертичная структура — образуют несколько независимо сфолдингованных (процесс образования пространственной структуры) полипептидных цепей для эффективного выполнения функции белка. Полипептиды в составе = субъединицы.

Связи: ковалентные, ионные, водородные, гидрофобные, дипольные, Ван-дер Ваальсовые (атомы боковых радикалов).

— ковалентные — самые прочные, 210 кДж/моль (S-S);

— ионные (электростатические) — между разнозаряженными боковыми радикала (лизин+ аргинин+ и аспарагин- глутаминовая-), 45 кДж/моль;

— водородные — поляризованные боковые радикалы с гидроксильными, амидными и тиогруппами, 8-12 кДж/моль;

— гидрофобные взаимодействия, 4-8,5 кДж/моль. В водных растворах неполярные радикалы внутрь молекулы (гидрофобное ядро), на поверхности гидрофильные образуют водородные и ионные связи;

— Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, 0,5 кДж/моль, в них участвуют все-все атомы: между атомами и молекулами, которые являются постоянными диполями. Зависит от расстояния между частицами.

3. Биологическая роль белков.

Фибриллярные белки: вытянутая форма, образуют тяжи-фибриллы. Практически нерастворимы в воде, составляют основу всех соединительных тканей. Коллаген — обеспечивает прочность структур: соединительнотканного слоя кожи, сухожилий, хящей, оргвещества костной ткани, роговицы глаза. Кератин — основной белок соединительных тканей, волос, когтей, костей и панцирей. Фиброин шелка — основа нитей паутины, коконов насекомых. СТРУКТУРНАЯ ФУНКЦИЯ (прочные, практически не растворяются в воде).

Глобулярные белки: растворимы в водных средах, могут быть представлены в виде шара с гидрофобным ядром и гидрофильным внешним слоем из АК с полярными или заряженными боковыми радикалами, которые образуют водородные и электростатические связи с водным окружением. Разнообразные пространственные структуры и комплексы ФУНКЦИЙ: каталитические, транспортные (гемоглобин, миоглобин), защитные, структурные, биолюминесценция (GFP).

Каталитическая — ферменты, энзимы;

Сократительная — актин, миозин;

Регуляторная — гормоны;

Транспортная;

Гемостатическая (свертываемость) — ферменты;

Рецепторная;

Генно-регуляторная (гистоны, репликация);

Имунная — антитела.

4. Пептидная связь. Химический и химико-ферментативный методы синтеза пептидов.

(Про пептидную связь №2)

Химически синтезированные полипептиды используются в качестве моделей для изучения.

Реакция конденсации с карбокси- и аминогруппами термодинамически невыгодна, поэтому для синтеза АК превращают в активные производные по концевым карбоксильной или аминогруппам. Вводимые активационные группы должны иметь электронно-акцепторную природу, чтобы увеличить дробный положительный заряд на углероде карбоксила. Тогда электронно-донорная атака пары электронов аминогруппы на обедненный электронной плотностью карбоксильный углерод будет более эффективной.

1. Блокирование "ненужных" функциональных групп (амино)

2. Активация альфа-карбоксильной группы

3. Однозначное образование пептидной связи

4. Удаление блокирующих групп, очистка целевого пептида

Так как в каждой АК есть минимум 1 каждая группа в итоге получается набор пептидов, различных по составу и длине, даже если активирована только одна АК. Чтобы пептид синтезировался в нужном направлении, необходимо заблокировать ненужные на данном этапе защитные ФГ, причем в мягких условиях, не разрушающих пептидную связь. Боковые радикалы тоже блокируют, так как могут образоваться разветвленные пептиды.

Защита групп и активация нужной группы. После окончания синтеза защитные группы удаляются, полипептид очищается хроматографически.

Процесс циклический (прибавляется по звену за раз), автоматизируется; первые звено иммобилизуют на поверхности нерастворимых частиц (шариков из нерастворимого полимерного материала), частицы в колонку, через колонку пропускают реагенты.

Итоговый продукт должен быть оптически чистым, обычно происходит частичная рацемизация пептидной связи. Ациламинокислоты → азлактоны (результат циклизации); пятичленные гетероциклы с азотом и кислородом в кольце.

Химико-ферментативный синтез: часть реакций при синтезе катализируется с помощью соответствующих ферментов. Ферментативные реакции обладают специфичностью как по направленности, так и по оптической чистоте продуктов.

Инсулин нужен для диабетиков, у свиньи похожий (аланин у свиньи, треонин у человека в одном месте). Инсулин свиньи очищают — блокируют карбоксильные группы диазометаном — обработка трипсином — B-цепь укорачивают — блокируют аминогруппы — синтезируют удаленный фрагмент B-цепи уже с требником на конце — полностью блокированный по "ненужным" ФГ укороченный инсулин свиньи соединяют с синтетическим фрагментом — деблокируют все ФГ — человеческий инсулин. Выход 10%.

5. Определение первичной последовательности полипептидов.

Основные этапы: выделение белка — определение молекулярной массы и субъединичного состава — определение АК состава — определение концевой АК (обычно N-конец) — деградация белка с получением коротких фрагментов — определение АК последовательности (секвенирование) — сборка фрагментов и установление последовательности.

1. Получение: различие в свойствах.

— дезинтегрирование исходного материала и получение экстракта с белком, белок переводят в раствор, потом фильтруют или центрифугируют;

— осаждение белков из раствора добавлением нейтральной соли (NH₄)₂SO₄. Это увеличивает ионную силу раствора, и гидрофобные белки осаждаются (высаливание);

— хроматография: взаимодействие вещества в подвижной фазе (жидкость или газ) с поверхностью неподвижной фазы (адсорбент), в результате образуются фракции с отдельными веществами. (Хроматография, потому что впервые на экстракте листа и на его пигментах.)

2. Определение молярной массы: эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация, проверка по проницаемости твердой фазы), гель-электрофорез (заряженная молекула движется в постоянном электрическом поле в определенном направлении, молекулы одинакового размера образуют зоны), масс-спектрометрия (движение заряженных частиц в магнитном поле).

3. Определение АК состава: полный гидролиз до свободных АК (инкубирование в 6 М HCl при 106 градусах), а затем анализ с помощью колоночной хроматографии (перевод в окрашенные соединения реакцией с красителями).

4. Определение концевой АК с помощью направленной химической модификации. Реакция N-концевой с дансилхлоридом или C-концевой с динитрофторбензолом с последующим полным гидролизом белка до АК. Далее хроматография: дансильные производные с флюоресценцией, динитрофенильные ярко-желтые.

5. Направленная деградация белка с помощью протеаз, расщепляющих полипептидную цепь в определенных участках (по конкретным остаткам). Трипсин — только по основным, лизинам или аргининам. Остатки разделяют с помощью хроматографии и секвенируют отдельно.

6. Для секвенирования обрабатывают фенилизотиоцианатом, он взаимодействует с аминогруппой на N-конце с отщеплением концевой АК, другие не трогает. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное идентифицируют хроматографией. Процедуру повторяют, идентифицируют следующую АК и так до конца. Секвенирование Эдмана.

7. Для установления последовательности исходного белка проводят сборку фрагментов, учитывая условия их получения при гидролизе, начиная с C-концевой АК.

БИОХИМИЯ БИЛЕТЫ #6-12 (нуклеотиды)

6. Нуклеозиды и нуклеотиды как компоненты нуклеиновых кислот: структура, физические и химические свойства

Нуклеотиды — сложные эфиры нуклеозидов и фосфорных кислот. Нуклеозиды — гликозиды с гетероциклическим фрагментом и с остатком сахара.

Нуклеиновые кислоты — линейные полимерные молекулы из нуклеотидов. Каждый нуклеотид: гетероциклическое основание, углеводный остаток и остаток фосфорной кислоты.

О снования: 6-членные, пиримидины (тимин Thy T, урацил Dra U, цитозин Cyt C) и 5- 6- членные пуриновые (аденин Ade A и гуанин Gua G). Азота много, слабый основный характер — азотистые основания. Поглощают УФ при 260 нм.

У глеводные остатки: рибоза и дезоксирибоза (через гликозидную связь). Основания + углеводные остатки = нуклеозид: аденозин, гуанозин, тимидин, уридин, цитидин. Нуклеозиды с рибозой — рибонуклеозиды (все, кроме тимидина), с дезоксирибозой — дезоксирибонуклеозиды (все, кроме урацила).

О статки фосфорной кислоты: трехосновная, при взаимодействии со спиртами может образовывать моно- ди- и триэфиры. У рибонуклеозидов гидроксилов 2, у дезоксирибо — 3. У РНК только 3'-5' связь.

Остаток фосфорной кислоты — диэфир, а третья кислотная группа свободна и в водной среде диссоциирует; в результате все молекулы нуклеиновых кислот сильно отрицательно заряжены и представлены в виде солей одно- двухвалентных металлов.