Необходимые условия для трансляции:
1. расплетенный участок ДНК - одна нить ДНК;
2. строительный материал, представленный нуклеотидами - рибонуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ);
3. энергия, которая выделяется из вышеперечисленных трифосфатов: АТФ АМФ + ФФн +Q;
4. ферменты - ДНК-зависимая РНК-полимераза.
Этапы трансляции:
1. инициация (начало);
2. элонгация (продолжение);
3. терминация (окончание).
После транскрипции идет процессинг (созревание) РНК.
1. Инициация - заключается в присоединении ДНК-зависимой РНК-полимеразы к промотору, что приводит к разрыву водородных связей между комплементарными нуклеотидами и расхождение нитей ДНК.
2. Элонгация - это передвижение РНК-полимеразы вдоль нити ДНК, сопровождающееся образованием фосфодиэфирных связей между рибонуклеотидами. Присоединение рибонуклеотидов происходит в соответствии с принципом комплементарности.
Этот синтез идет от 5' конца к 3' концу со скоростью 40- 50 нуклеотидов в секунду. Данная фаза протекает до тех пор, пока ДНК-полимераза не достигнет стоп-сигнала, после чего происходит терминация. В результате процессов транскрипции образуется транскрипт (пре-иРНК). Он почти полностью соответствует транскриптону.
Начинается следующий этап - процессинг - посттранскриптационное созревание РНК. Заключается в:
- удаление излишков - вырезаются неинформативные участки;
- сплайсинг - сшивка, соединение информативных участков. При этом иРНК укорачивается. Из пре-иРНК образуется иРНК. Далее иРНК соединяется с белком-информером, в результате чего образуется комплекс иРНК+ белок =информосома, который может выходить из ядра и транспортироваться в цитоплазму к рибосоме, где начинается следующий этап передачи информации - трансляция.
Центральный постулат генетики (Уотсон и Крик): ДНКРНКбелок. В 70-е годы был обнаружен фермент - ревертаза (обратная транскриптаза), который позволяет по иРНК синтезировать участок ДНК (РНКДНК). Этот процесс называется обратной транскрипцией.
Трансляция (биосинтез белка)
Трансляция - перевод генетического текста иРНК в последовательность АК в белке.
Необходимый комплекс факторов:
1. строительный материал (20 АК);
2. молекулы тРНК (61 вид тРНК). 61 кодону соответствует 20 АК. 1 тРНК распознает более 1 кодона;
3. ферменты: аминоацил-тРНК-синтетаза - обеспечивают узнавание и связывание АК со своей тРНК (20);
4. молекула мРНК. У эукариот иРНК имеет так называемый 'кэп' (от англ.- кепка, шапка) в области 5'-конца. Кэп представлен метил-ГТФ, необходимой для узнавания иРНК рибосомой и участвует в трансляции;
5. рибосомы, как место синтеза белка. Каждая рибосома состоит из малой и большой субъединиц. У прокариот они более мелкие - 70S: малая субъединица - 30S, большая - 50S. (S- скорость осаждения). У эукариот- 80S: малая - 40S, большая- 60S. Рибосома содержит рРНК, а также около 80 различных белков, в том числе и ферментов.
6. энергия АТФ и ГТФ;
7. ионы Мg2+, необходимые для активации ферментов;
8. белковые факторы трансляции - специфические белки различных этапов трансляции.
Этапы трансляции:
1. рекогниция - «распознавание»;
2. инициация - «начало»;
3. эллонгация - «продолжение, удлинение»;
4. терминация - «прекращение»;
5. процессинг - «созревание».
1. Рекогниция. Происходит связывание АК со своей тРНК: АК+тРНК(над стрелкой - аминоацил-тРНК-синтетаза, АТФ) аминоацил-тРНК +АМФ+2Фн Количество этих реакций зависит от количества АК.
2. Инициация. Состоит из 7 фаз:
а) подготовка рибосомы к трансляции. Рибосома (30S) взаимодействует с фактором инициации 3 (ФИ-3), в результате разделяется на малую и большую субъединицы. Малая субъединица находится в комплексе с ФИ-3;
б) подготовка РНК-матрицы к трансляции. мРНК эукариот в области 5'-конца имеет особую структуру - КЭП, представленную метил-ГТФ. В этой фазе происходит присоединение к КЭПу КЭП-связываемых белков. Они обозначают на мРНК место прикрепления рибосомы;
в) подготовка инициаторной аминоацил-тРНК. Кодон, с которого начинается считывание генетической информации, представлен триплетом АУГ - метионин. В качестве инициаторной будет выступать МЕТ-тРНК: МЕТ-тРНК+ГТФ+ФИ-2 инициаторный метионин-тРНК;
г) образование инициирующего комплекса. При этом инициаторная МЕТ-тРНК взаимодействует с малой субъединицей рибосомы с образованием инициирующего комплекса. Этому процессу способствует белковый ФИ-3, связанный с рибосомой;
д) связывание мРНК с инициирующим комплексом: инициирующий комплекс+ ФИ-1+ 5'-конец мРНК. При этом АТФАДФ+Фн;
е) поиск и комплементарное взаимодействие со стартовым кодоном. При этом происходит скольжение малой субъединицы рибосомы до момента обнаружения кодона АУГ и комплементарного взаимодействия с ним антикодона МЕТ-тРНК;
ж) формирование 80S-рибосомы. Большая субъединица присоединяется к комплексу, образующемуся на 6 стадии, что сопровождается затратой энергии ГТФ (ГТФГДФ+Фн). Для этой реакции используется ГТФ, находящаяся в составе инициирующего комплекса. В образовавщейся рибосоме выделяют 2 участка:
- Р-участок, в котором находится МЕТ-тРНК. Здесь будет происходить образование пептидных связей - сайт Р;
- А-участок (аминоацильный участок) - служит для присоединения аминоацильной-тРНК.
В завершении этой фазы происходит высвобождение белковых факторов ФИ-1, ФИ-2, ФИ-3 и КЭП-связанных белков.
3. Элонгация. Состоит из 3-х фаз:
а. присоединение следующей аминоацил-тРНК в соответствии со смыслом следующего кодона матрицы. Процесс требует энергии ГТФ ГДФ + Фн+Q и белкового фактора - фактор элонгации-1 (ФЭ-1);
б. пептизация. Между АК-остатками образуются пептидные связи (между АК-1 и АК-2). Данную реакцию катализирует пептидил-трансфераза. Этот фермент разрушает связь между первой АК и ее тРНК. Первая тРНК покидает рибосому. В результате в амино-ацильном участке рибосомы находится растущий пептид, а Р-участок освобождается;
в. транслокация или перемещение. Рибосома перемещается на 1 кодон в направлении 3'-конца тРНК. При этом пептдтл-тРНК остается на месте и происходит внутририбосомный переход растущего пептида из А-участка рибосомы в Р-участок. Для данного процесса необходимы энергия ГТФ ГДФ + Фн+Q и белковый фактор - ФЭ-2. Основным результатом является освобождение А-участка рибосомы, в который может поступить следующая аминоацил-тРНК.
Процесс элонгации протекает циклически с 1 по 3 фазу до момента обнаружения стоп-кодона. При достижении рибосомой нонсенс-кодона элонгация прекращается и наступает терминация.
4. Терминация.
Нонсенс-кодон распознается белковыми R-факторами (факторы освобождения) в А-участке рибосом. В результате действия R-факторов обеспечивается диссоциация элементов трансляционного аппарата и в цитоплазму высвобождаются рибосома, иРНК, полипептид. СЭС между пептидом и тРНК гидролизуется с затратой энергии ГТФ ГДФ + Фн+Q. иРНК в дальнейшем может использоваться повторно для трансляции (до разрушения ее иРНКазами).
Собственно трансляция включает 3 этапа: инициация, элонгация, терминация.
5. Процессинг белка.
Это совокупность изменений в структуре белка (полипептида), которые заканчиваются формированием структурно и функционально зрелой белковой молекулы. Процессинг может быть 2-х видов:
- котрансляционный, протекающий во время трансляции;
- посттрансляционный - химическая можификация белка происходит после трансляции.
Включает несколько видов химической модификации:
- ограниченный протеолиз - это отщепление либо пептидного фрагмента, либо N-концевой АК (МЕТ);
- реакция ацетилирования - присоединение ацетильного остатка;
- фосфорилирование - присоединение остатка фосфорной кислоты с образованием сложных белков (фосфопротеины);
- гликозилирование АК с образование гликопротеинов и протеогликанов;
- гидроксилирование АК - присоединение -ОН группы. Наиболее часто данному процессу подвергаются ПРО и ЛИЗ с образованием гидроксипролина (ОПР) и гидроксилизина (ОЛИ). Этот процесс необходим при образовании коллагена;
- окисление АК;
- образование вторичной, третичной и четвертичной структур - характерно для олигомерных белков. При образовании данных структур белок сворачивается - процесс фолдинга. Для этого необходимы специализированные белки - шапероны. Они ускоряют сворачивание белков, исправляют некорректные формы вторичной, третичной структур. Может наблюдаться патология фолдинга: существуют т.н. отрицательные шапероны. Их присутствие в клетке приводит к неправильному фолдингу, что выражается в гибели клеток.
Адресование белков
После синтеза и процессинга белки должны быть правильно размещены в клетке либо правильно выделены на экспорт. Этим управляют особые механизмы адресования белков.
В структуре белка имеется т.н. сигнальный участок, содержащий информацию о принадлежности данного белка к определенной органелле клетки или о выделение белка на экспорт. Функцию сигнального участка выполняет фрагмент аминокислотной последовательности либо углеводный компонент.
Принципы адресования заключаются в процессе распознавания белков определенными органеллами. При этом распознание сигнального участка происходит только в случае, если он «пришел» в правильное место.
Гидрофобные АК сигнального участка направляет белок в ЭПР (мембранная структура); гидрофильные АК - в жидкие среды клетки (цитоплазма) или во внутренне пространство органелл; углеводный компонент адресует белок в кровь или лимфу.
Регуляция биосинтеза белка
Клетки многоклеточного организма содержат одинаковый набор ДНК, но белки синтезируются разные. Например, соединительная ткань активно синтезирует коллаген, а в мышечных клетках такого белка нет. В эритроцитах содержится Нb, и информация о Нb содержится во всех клетках. С возрастом скорость синтеза изменяется.
Прокариоты.
Теория регуляции биосинтеза у прокариот была разработана в 1961 г. Ф. Жакобом и Ж. Моно. Основные положения теории:
1. неоднородность генетического материала. В геноме имеются:
- структурные гены, которые кодируют синтез структурных белков или ферментов;
- регуляторные гены. Обеспечивают регуляцию считывания информации со структурных генов.
2. регуляция биосинтеза происходит на этапе транскрипции;
3. регуляция осуществляется путем репрессии (подавление транскрипции) и индукции (разрешение транскрипции).
Пр.: работа лактозного оперона.
В клетках микробов имеется фермент лактаза, участвующий в расщеплении лактозы до галактозы и глюкозы. Этот фермент в их клетках вырабатывается только при наличии субстрата - лактозы. Регуляция осуществляется с помощью лактозного оперона. Так, если в среде нет лактозы, то ген-I кодирует синтез белка-репрессора. Белок-репрессор взаимодействует с оператором и в результате РНК-полимераза не может осуществлять транскрипцию. Этот тип регуляции называется репрессией.
Если в среде присутствует лактоза, то она препятствует взаимодействию белка-репрессора с операторм, РНК-полимераза считывает информацию и образуется мРНК лактазы. Т.о. лактоза является индуктором, т.е. веществом, препятствующим взаимодействию белка-репрессора с оператором, в результате чего усиливается и облегчается транскрипция гена лактазы.
У прокариот первичные транскрипты генов (мРНК) используются в синтезе белка еще до завершения процесса транскрипции. У них нет ядерной мембраны.
Эукариоты.
Основные уровни регуляции биосинтеза:
1. на уровне транскрипции. Варианты:
- групповая репрессия генов белками - гистонами;
- амплификация генов - увеличение числа копий заданного участка ДНК или гена. Достигается в результате многократного синтеза ДНК в одном и том же репликативном пузыре. В этом случае транскрипция будет возможна сразу с нескольких копий гена, что увеличивается скорость транскрипции. Эта регуляция изучается у опухолевых клеток, которые способны к амлификации;
- регуляция сигналами-усилителями. Сигналы-усилители - энхансеры - выступающий участок ДНК, который может быть значительно удален от промотора. Под действием энхансера наблюдается более чем 200-кратное увеличение скорости транскрипции. Действует неспецифично, усиливая транскрипцию многих генов.
Пр.: действие гормонов коры надпочечников: глюкокортикоиды проникают внутрь клетки, где взаимодействуют с рецептором, посредством чего проникают в ядро, где присоединяются к ДНК и превращают участок ДНК в энхансер. При этом запускается синтез ферментов, характерных для действия глюкокортикоидов. Данный механизм работает только у эукариот.
2. регуляция на уровне процессинга иРНК:
- разрешение или запрещение процессинга. Так, не все пре-иРНК превращаются в зрелые иРНК: пре-иРНК иРНК;
- дифференциальный (альтернативный) процессинг. В клетках эукариот возможен многовариантный процессинг, поэтому утверждение 1 ген1 белок для них не всегда справедливо. Это происходит в результате потери некоторых экзонов.