Материал: Антибактеріальна активність фітонцидів та гемоглютинуюча властивість лектинів деяких голонасінних рослин

Рослини, котрі містять велику кількість ефірних олій називаються ароматичними. Речовини, які належать до цієї групи, в більшості випадків нерозчинні у воді, але розчинні в багатьох органічних розчинниках. Ефірні олії характеризуються певними ароматами і тому визначають запах багатьох рослин.

Водний 5% розчин соснової ефірної олії вбиває бактерії тифу і бацили Шига (збудник дизентерії) протягом 2 хвилин, коліобактерії - за 2 - 8 хвилин, стрептокок і дифтерійну паличку - за 4 хвилини, стафілокок - за 6 хвилин, паличку Коха (збудник туберкульозу) - за 60 хвилин.

Ефірні олії як і фітонциди є не лише агресивними по відношенню до мікроорганізмів, а й практично нешкідливими для організму людини (на відміну від антибіотиків).

Методи виділення ефірних олій:

.) метод поглинання, оснований на властивості жирів поглинати ефірні олії, що випаровуються з ефіроносних органів (застосовується для духмяних квіток, тонкий запах яких змінюється при перегонці);

.) поглинання активованим вугіллям, який характеризується тим, що з вугілля олію екстрагують спиртом;

.) метод мацерації, оснований на здатності ефірних олій розчинятися в жирах. Полягає в настоюванні багатих ефірними оліями органів рослин на жирних оліях. Проводиться також екстрагування ефірної олії легко киплячими рідинами, що потім відганяються.

Найпоширенішим є метод перегонки сировини з водяною парою.

Властивості ефірних олій:

а.) легко вбираються шкірою і проникають глибоко в тканини, впливаючи не лише на поверхню шкіри, але і на весь організм.

б.) на відміну від хімічних препаратів ефірні олії мають нормалізуючий ефект і діють тільки тоді, коли в організмі порушені певні процеси;

в.) ефірні олії подібно фітонцидам характеризуються антисептичними властивостями, а тому згубно діють на патогенні мікроорганізми;

г.) ефірні олії сприяють виробленню в організмі людини ендорфінів та серотонінів, здатних покращувати настрій, самопочуття та розслабляти організм.

д.) нормалізують психоемоційний стан людини.

2.4 Ялинова ефірна олія та її властивості

Ефірна олія ялини європейської - безбарвна прозора рідина. Має характерний для хвойних лісів духмяний запах. Смак гіркий, пекучий, освіжаючий, дуже схожий на живицю Pinus sylvestris. Погано розчиняється у воді. Хімічний склад: пінен, кадінен, камфен, дипентен, сантен, фелландрен, борнілацетат, мурашина та янтарна кислоти.

Ялинову ефірну олію отримують паровою перегонкою з зелених гілок ялини. Вихід складає 0,3 - 0,5 % від маси сировини. Цим в основному і пояснюється його антимікробна активність, особливо по відношенню до стафілокока. В давнину жителі північних сіл робили зруби з ялинових стовбурів. В народі говорили: «Хоть изба и еловая, да сердце здоровое». Здавна ялинова хвоя застосовувалася як сечогінний та жовчогінний засіб. Настій ялинової кори пили при серцевих захворюваннях, при захворюваннях суглобів приймали ялинові ванни, смолою ялини користувалися як кровоспинним та ранозаживляючим засобом. При цинзі пили ялиновий сік або настій хвої. Застосовувалася ялинова хвоя також і для знезараження приміщень: окурювали запаленими ялиновими гілками людей, в котрих прогресували захворювання легенів. Підлогу в приміщеннях, де перебували хворі, посипали хвоєю. Ці лікувальні властивості хвої пояснюються наявністю в ній ефірної олії, котра з успіхом застосовується для лікування багатьох захворювань. Так, при рахітах, астмі, пневмонії, грипі, інфекціях сечовидільних шляхів рекомендують приймати внутрішньо 2-3краплі ефірної олії ялини з медом чи відваром трав. При ревматизмі, застуді використовують ароматичну олію наступного складу: ялинова олія 5-7крапель, соняшникова олія 10мл.

Спиртовий розчин ялинової олії (10 крапель олії на 10мл етилового спирту) рекомендується приймати як засіб для сауни, розтирання ніг при пітливості і для ароматизації повітря в приміщення. При застуді та ревматизмі у ванну додають 10мл цього розчину.

Використання ялинової ефірної олії в якості джерела летучих ароматичних речовин при проведенні сеансів ароматерапії дозволяє знизити застудні та вірусні захворювання у холодні періоди року.

2.5 Ефірна олія кедра сибірського та її властивості

Рекомендується для стимулювання регенерації та підвищення пружності шкіри, росту волосся, усунення лупи; як ідеальний засіб при респіраторних захворюваннях, бронхітах; як антисептичний, бактерицидний, противірусний, імуномоделюючий, протизапальний, спазмолітичний, відхаркуючий засіб.

З кедрової олії виробляють гліцеринові ефіри. Нерафінована кедрова олія має світло - жовтий відтінок, ніжний горіховий аромат і успішно конкурує як делікатесний продукт з кращими харчовими оліями.

Російські лікарі застосовували кедрову олію при лікуванні гіпертонії, атеросклерозу, виразки шлунку. Застосовували його і зовнішньо - для лікування опіків, ран, проводили інгаляції, ванни та масажі.

Смак в кедрової олії приємний, колір ясно - жовтий або золотисто - янтарний, чудовий горіховий аромат. Погано розчиняється у воді. Хімічний склад: кедрол, кедренол, кедрен, купарен, пінен.

.6 Опис бактерій що досліджувались

Кишкова паличка (Escherichia coli)

Мікроорганізм виділив з випорожнень Т. Ешеріх у 1885 p. Е. coli відноситься до роду Escherichia.. coli - мешканець товстої кишки людини та ссавців, є також у кишечнику птахів, риб, рептилій, амфібій і комах. Виділяючись у великій кількості з випорожненнями, завжди є у навколишньому середовищі (грунт, вода, предмети).

Морфологія. Е. coli відноситься до грамнегативних паличок. Характеризується поліморфізмом.

Культивування. Е. coli - факультативний анаероб, оптимум росту при температурі ЗО - 37 °С, рН7,2 - 7,5, добре розмножується при кімнатній температурі на звичайних середовищах, росте в діапазоні температур 10 - 45 °С у перші 2 доби. Е.соlі пойкілотермних організмів культивуються при температурі 22 - 37 °С, при 42 - 43 °С ріст їх затримується.

На м'ясолактоному агарі (МЛА) розвивається у вигляді слабко випуклих напівпрозорих сіруватих колоній, в м'ясопептоному бульйоні (МПБ) спричиняє дифузне помутніння з утворенням осаду.

Резистентність. Е.соlі у зовнішньому середовищі зберігається протягом кількох тижнів і навіть місяців. Вона стійкіша проти дії фізичних і хімічних факторів зовнішнього середовища, ніж сальмонели і шигели. Е.соlі порівняно швидко гине при дії дезинфікуючих засобів. Температура 55 °С спричиняє її загибель через 60 хв., а 60 °С - через 15хв.

Синьогнійна паличка (Pseudomonas aeroginosa)

Виявлена А. Люкке в 1862 р. Віднесена до роду Pseudomonas.

Морфологія. Синьогнійна паличка - поліморфна грамнегативна рухлива бактерія, іноді трапляється у вигляді клітини з двома і більшою кількістю джгутиків. Довжина синьогнійної палички 1,5-3мкм, ширина 0,5мкм. У мазках розташовуються поодинокими особинами.

Культивування. Синьогнійна паличка - облігатний аероб. Оптимальна температура росту 37 °С, але може розвиватись і при 40-41 °С. Більшість штамів синьогнійної палички продукує пігмент піоцианін, який має синій колір у нейтральному або лужному середовищі і червоний колір у кислому середовищі. Є штами, які утворюють пігмент темно - червоного кольору.

Резистентність. При температурі 60 °С синьогнійна паличка гине протягом 1 год., чутлива до дії дезинфікуючих засобів.

Стафілокок золотистий (Staphylococcus aureus)

Стафілокок (Staphylococcus aureus) вперше виділив із гною фурункула Л. Пастер у 1880 p. Стафілококи входять до родини Місгососсасеае.

Морфологія. Стафілококи сферичної форми, діаметром 0,5 - 1,5мкм, розташовуються у вигляді неправильних безсистемних скупчень. У мазках із культури і гною утворюються короткі ланцюжки, іноді представлені парними і одиночними коками. Стафілококи не мають джгутиків, не продукують спор, деякі штами утворюють капсулу, грампозитивні.

Культивування. Стафілококи - факультативні анаероби. Вони добре розвиваються на звичайних поживних середовищах з рН7,2 - 7,4 при температурі 37 °С (межі діапазону росту - 10-45 °С). При кімнатній температурі, широкій аераціїі, розсіяному світлі стафілококи виробляють золотисті, білі, лимонно - жовті та інші пігменти. Найбільш інтенсивно пігменти утворюються на молочному агарі і картоплі при температурі 20 - 25 °С.

Резистентність. Стафілококи характеризуються порівняно високою стійкістю. У висушеному стані вони зберігаються понад 6 місяців, у пилу - 50 - 100 діб. Повторне заморожування і розморожування не вбиває стафілококів. Вони витримують дію прямого сонячного випромінювання протягом багатьох годин, нагрівання при температурі 70 °С - понад 1 год.

Протей (Proteus)

Протей (Proteus) виділений Г. Хаузером у 1885 р.

Морфологія. Протей - це поліморфна грамнегативна паличка 1 - 3мкм завдовжки і 0,4 - 0,8мкм завширшки. Розташовується попарно або ланцюжками, спор і капсул не утворює, рухлива, перитрих .

Культивування. Бактерії із групи протеїв - факультативні анаероби. Добре ростуть на звичайних живильних середовищах. Оптимальна температура росту 25 - 37 °С (10 - 43 °С). Утворюють два види колоній. Перша форма колонії має вигляд «рою» , друга - колонії великі, з рівними краями.

Резистентність. Палички протея порівняно стійкі проти фізичних факторів, при температурі 60 °С зберігаються протягом 1год, витримують низькі температури, дію 10 - 12 % розчину натрію хлориду.

РОЗДІЛ 3. Практичне визначення фітонцидних властивостей Picea abies та Pinus sibirica

.1 Методика визначення фітонцидних властивостей Picea abies та Pinus sibirica

Для визначення фітонцидних властивостей різних рослин можуть використовуватися такі методи: метод агарових блоків, метод перпендикулярних штрихів, метод жолобка, метод середніх розведень, метод паперових дисків або металевих циліндриків.

З метою визначення фітонцидних властивостей Picea abies та Pinus sibirica нами використовувався метод паперових дисків.

Суть вищезгаданого методу полягає в тому, що диски фільтрувального паперу змочують ефірними оліями Picea abies та Pinus sibirica. Потім диски кладуть на поверхню агаризованого середовища, засіяного тест - культурами Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Escherichia coli.

Диски розміщують на поверхні агаризованого середовища з посівом на однаковій відстані одне від одного, та на відстані 2см від краю чашки. На одній чашці слід розміщувати не більше 6 дисків. Чашки інкубують протягом 18-20 годин при 35 - 37 °С, перевернуті догори дном.

Через добу за допомогою штангенциркуля вимірюють діаметр зон затримки росту навколо дисків (зон гальмування), включно з діаметром самих дисків з точністю до 1мм.

Виконання даної роботи необхідне для визначення рівня чутливості певних мікроорганізмів до фітонцидів ялини європейської та кедру сибірського.

3.2 Методика виявлення і виділення лектинів з рослинної сировини

Загальноприйнятим методом виявлення лектинів є аглютинація еритроцитів.

Еритроцити є найбільш доступними клітинами і використовуються в якості тест-об’єкта з початку досліджень лектинів. Крім того, еритроцити не потребують додаткового підфарбовування. Для пошуку лектинів рекомендують використовувати суспензію еритроцитів людини, барана, кроля, курки. Результати реакції, тобто наявність чи відсутність аглютинації, оцінюють за характером осаду еритроцитів. Час, що необхідний для осідання, коливається від 45 хв. До 2 год., в залежності від видової приналежності еритроцитів, об’єму реакційної суміші та температури. Швидше осідають «важкі» еритроцити птахів, оскільки вони мають ядра. За більш високої температури реакція гемаглютинації відбувається швидше, ніж за низької. Приготування суспензії еритроцитів проводять шляхом відмивання еритроцитів від плазми крові буферним фізіологічним розином. Для цього 10-15 краплин крові збирають у пробірку з 10мл буферного фізіологічного розчину, перемішують і через 10 хв. Центрифугують при 1500 обертах протягом 5 хв. Склад буферного фіз.. розчину: 1 л дистильованої води; 8.0г NaCl; 0.2г KCl; 1.15г NaH2PO4. рН доводять до 7.4 за допомогою слабкого розчину НСl. Еритроцити відмивають 1-2 рази буферним фізіологічним розчином. Для пошуку лектинів рекомендують використовувати 2% суспензію еритроцитів людини груп 0, А, В або еритроцити кроля и барана.

Для виділення лектинів, рослинну сировину висушують при температурі не вище 50 градусів, після чого подрібнюють до частинок 1мм. Екстракцію лектинів проводять 0.9%-вим розчином NaCl у співвідношенні 1:5-1:10 протягом двох годин при безперервному перемішуванні. Екстракт віджимають і центрифугують 5-10 хв. При 3000-6000 обертах для видалення нерозчинного залишку. Із свіжої рослинної сировини, лектини виділяють шляхом подрібнення відповідного органу рослини та віджимання соку.

В лунку планшета вносять по 0.05мл буферного фіз. розчину, далі у першу лунку додають 0.05мл рослинного екстракту і перемішують. З першої лунки переносять в другу 0.05мл суміші, з другої - 0.05 в третю тощо. Далі в кожну лунку вносять по 0.05мл суспензії еритроцитів перемішують і залишають при кімнатній температурі на 0.5-2 год. Результати досліду оцінюють, розглядаючи лунки згори. При відсутності аглютинації еритроцити збираються в центрі дна лунки у вигляді крапки. Аглютиновані еритроцити вкривають дно лунки у вигляді диска. Якщо діаметр диска менше 2-х мм або має форму кільця, то гемаглютинація оцінюється в 1 бал. Якщо діаметр диска від 2-х до 5-ти мм (іноді край у вигляді зонтика), то бал дорівнює 2, а якщо діаметр більше 5-ти мм, оцінюється в 3 бали. Титр лектину виражається у вигляді максимально розведення екстракту, при якому ще спостерігається аглютинація еритроцитів.

.3 Результати дослідження фітонцидних властивостей ефірної олії Picea abies

Провівши дослід по визначенню антибактеріальної активності Picea abies, заміряли діаметри зон гальмування. Результати представлені в таблиці 3.3. (Додаток А)

В літературі ялинову ефірну олію розглядають як ефективний антибактеріальний засіб, котрий забезпечує санацію повітря не лише в побутових,  а й в госпітальних установах. Підкреслюється висока антистафілококова активність ефірної ялинової олії. Згідно отриманих результатів найбільшу активність ефірна олія Picea abies демонструє по відношенню до Proteus vulgaris (зона гальмування 10.5 мм).

За шкалою антибактеріального впливу ялинової олії всі дослідження культури можна розташувати в такий ряд Proteus vulgaris > Pseudomonas aeruginosa > Escherichia coli > Staphylococcus aureus. Таким чином можна зауважити, що ефірна олія з ялини європейської має більший вплив на грамнегативні види бактерій, ніж на грампозитивні. Ці дані кажуть на користь гіпотези, що ялинова ефірна олія впливає не на муреїн бактеріальної клітини, а на апарат біосинтезу білків, зокрема на 70 s рибосоми.

.4 Результати дослідження фітонцидних властивостей ефірної олії Pinus sibirica

Провівши дослід по визначенню антибактеріальної активності Pinus sibirica, заміряли діаметри зон гальмування. Результати представлені в таблиці 3.4. (Додаток Б)

Кедрова ефірна олія характеризується антибактеріальною активністю до кожного з досліджуваних мікроорганізмів. Найбільш чутливою до дії кедрової олії виявилася культура ( Proteus vulgaris). Найменша чутливість до кедрової олії у Staphylococcus aureus. За шкалою антибактеріального впливу кедрової олії всі дослідження культури можна розташувати в такий ряд Proteus vulgaris > Pseudomonas aeruginosa > Escherichia coli > Staphylococcus aureus. Такий ряд дозволяє припустити, що кедрова олія є активнішою по відношенню до грамнегативних бактерій. Найменша активність спостерігається по відношенню до грампозитивних бактерій. Тому дану олію можна рекомендувати для знезараження повітря побутового, навчального та лікувального спрямувань.

.5 Результати дослідження гемаглютинуючих властивостей лектинів

Picea abies та Pinus sibirica по відношенню до мембран еритроцитів чотирьох груп крові людини

Результати представлені у таблицях 3.5.1 та 3.5.2.

Таблиця 3.5.1.

Результати дослідження гемаглютинуючих властивостей лектинів Pinus sibirica

Таблиця 3.5.2.

Результати дослідження гемаглютинуючих властивостей лектинів Picea abies