Министерство образования и науки Украины
Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина
Кафедра
генетики и цитологии
КУРСОВАЯ РАБОТА
на
тему: Анализ соматических проявлений гибридного дисгенеза у Drosophila
melanogaster (на модели признака cubitus interruptus Dominant)
Студентки 4 курса группы БГ-42
направление подготовки биология
Костоглодовой Анжелы
Руководитель: доцент
кафедры генетики и цитологии, к.б.н.
Волкова Н.Е.
г. Харьков
год
РЕФЕРАТ
Работа изложена на 48 страницах компьютерного текста, содержит 6 рисунков и 47 источников литературы.
Ключевые слова: дрозофила, мобильные элементы генома, гибридный дисгенез, соматические проявления гибридного дисгенеза, признак ciD, ген ciD, экспрессивность.
В ходе выполнения работы экспериментально установлена изменчивость экспрессивности признака cubitus interruptus Dominant Drosophila melanogaster при индукции синдрома гибридного дисгенеза. Установлено, что система гибридного дисгенеза в соматических клетках характеризуется следующим эффектом. У гибридов ciDC-S x Пирятин, наблюдается разнонаправленный эффект. Так при снижении уровня атрофии гонад наблюдается увеличение экспрессивности признака ciD.. В эксперименте также был обнаружен и однонаправленный эффект. У гибридов ciDC-S x W-10 наблюдается уменьшение процента атрофии гонад и при этом снижается экспрессивность признака ciD.
гибридный дисгенез атрофия гонада
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
. Обзор литературы
.1 Мобильные элементы D.melanogaster как индукторы гибридного дисгенеза
.2 Явление и значение атрофии гонад, как признака гибридного дисгенеза
.3 Соматические проявления гибридного дисгенеза и механизмы их формирования
.4 Связь экспрессивности признака cubitus interruptus Dominant с экспрессией гена ciD
. Материалы и методы исследования
.1 Модельный объект
.2 Материал исследования
.3 Методы исследования
.3.1 Схема эксперимента
.3.2 Тест на атрофию гонад
.3.3 Методика оценки экспрессивности признака cubitus interruptus Dominant
.3.4. Методы статистического анализа
. Охрана труда
.Результаты и обсуждения
Выводы
Список
литературы
ВВЕДЕНИЕ
Мобильные генетические элементы (МГЭ) являются составной частью всех изученных геномов как про- так и эукариотических организмов [21]. Не смотря на то, что МГЭ широко распространены в геномах разных видов, большинство экспериментально доказанных представлений о механизмах их активности и контроля перемещений связаны с исследованиями на дрозофиле [2]. Так, мобильные генетические элементы представляют собой дискретные сегменты ДНК, которые могут перемещаться из одного местоположения в другое внутри хромосом или между ними. Геном Drosophila melanogaster содержит около 50-ти различных семейств мобильных генетических элементов, которые вместе составляют 10-15 % ДНК этого вида. Число копий элементов отдельных семейств варьирует от нескольких до сотни, и при активации они могут оказывать значительное влияние на функционирование генома и на генетическую изменчивость [31].
МГЭ имеют несколько механизмов перемещения и могут выполнять разные функции, в связи с чем, активация различных семейств мобильных элементов может иметь как отрицательные, так и положительные последствия для генома хозяина [29].
Выяснение механизмов действия МГЭ на геном эукариот является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной генетики. Показано, что транспозиционная активность МГЭ является основным источником мутагенеза и что существенную роль в регуляции мутабильности в природных популяциях дрозофил играет семейство Р- и hobo- транспозонов, активность которых максимальна в условиях Р-М и Н-Е системах гибридного дисгенеза соответственно [39]. Широкое географическое распространение этих транспозонов и их причастность к вспышкам частот мутаций значительно усилило интерес к изучению популяций, имеющих Р- и hobo-цитотип. Тем более что аналогичные генетические структуры обнаружены и у других высших организмов, в том числе и у млекопитающих [25].
К настоящему времени накоплены следующие данные. Большая часть генных мутаций у дрозофилы - это результат инсерций МГЭ. Инсерции МГЭ могут изменять активность генов, так как в своей структуре содержат мотивы систем управления (регуляторные элементы генов) и энхансеры, состоящие из нескольких модулей, и поэтому они обладают способностью связываться с различными регуляторными белками, активирующими процесс транскрипции. Такая способность мобильных элементов изменять (понижать или повышать) уровень активности близлежащих генов оказалась достаточно неожиданной [40]. Изучение первичной последовательности МГЭ выявило, что в их структуре есть большое количество регуляторных сайтов и сигнальных последовательностей. Это значит, что МГЭ могут очень интенсивно воздействовать на работу гена, не разрушая сам ген. В результате кроссинговера между МГЭ могут возникать хромосомные перестройки различных типов: инверсии, дупликации и делеции. МГЭ могут достраивать теломерные концы хромосом. МГЭ могут участвовать в горизонтальном переносе генов. МГЭ могут откликаться «вспышкой транспозиций» при различных стрессовых воздействиях на геном. Такие МГЭ, как Р- и hobo-транспозоны (и некоторые другие) обладают способностью вызывать синдром гибридного дисгенеза, что проявляется у потомства в виде повышенной частоты генных мутаций, хромосомных аберраций и нерасхождения хромосом, явления рекомбинации у самцов, а также стерильности гибридов [34].
Перемещения МГЭ у дрозофилы происходят преимущественно в клетках зародышевого пути. Попытки выявить активность МГЭ в клетках соматических тканей долгое время не были успешными, и сохранялось представление о том, что перемещения МЭ у дрозофилы ограничены половыми клетками [3]. Большая часть таких работ была проведена с использованием генетических методов и моделей на линиях Drosophila melanogaster при Р-М-гибридном дисгенезе. Молекулярными методами было подтверждено, что перемещения Р-элемента в клетках соматических тканей заблокированы за счет особенностей сплайсинга [22]. Для hobo-элемента так же предполагается тканеспецифичная регуляция продукции транспозазы, но на уровне транскрипции [28]. В ряде работ описаны случаи перемещения ретротранспозонов в соматических тканях у высших организмов [26]. Что касается транспозонов, до сих пор сохраняется неясность в вопросе о возможности их перемещения в соматических клетках у Drosophila melanogaster. Выявление возможности и изучение особенностей транспозиций МГЭ в соматических клетках имеет большое значение, поскольку в ряде работ описан повреждающий эффект соматических перемещений Р-элемента [34]. Одной из важных причин повышенного интереса к соматическим эффектам активного перемещения МГЭ является потенциальная угроза малигнизации клеток при соматическом мутагенезе.
Цель работы: установить изменяется ли экспрессивность признака cubitus interruptus Dominant Drosophila melanogaster при индукции синдрома гибридного дисгенеза.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Провести поиск и анализ литературы по теме исследования.
Освоить лабораторные методы работы с дрозофилой.
Поставить скрещивания самок линии ciDC-S D. melanogaster с самцами из линий, содержащих Р- или hobo-элемент, для индукции синдрома гибридного дисгенеза.
Проанализировать изменчивость проявления
признака cubitus interruptus Dominant у особей с гибридным дисгенезом и без,
потомков одних родителей.
. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
.1 Мобильные элементы D. melanogaster как индукторы
гибридного дисгенеза
МГЭ D. melanogaster по разным оценкам занимают от 15 до 22% всего генома. Это относительно небольшая часть по сравнению с высшими растениями, эндосимбиотическими бактериями и даже человеком. Каминкер в своей работе 2002 года, проанализировав геномную последовательность дрозофилы, установил наличие в ней 85 известных и 8 новых семейств МГЭ, которые встречались в количестве от 1 до 146 копий на геном. Идентифицировано 1572 полноразмерных и неполноразмерных МГЭ, что составляет 3,86% всей проанализированной последовательности эухроматина. Более чем две трети найденных элементов оказались неполноразмерными. В центромерных районах хромосом плотность МГЭ в 4,7 раз больше, чем в других районах. МГЭ дрозофилы предпочитают встраиваться в межгенные пространства, и часто располагаются в пределах другого МГЭ того же или иного класса и эти оценки не окончательны [40].
Сегодня МГЭ (их активация) считаются одним из основных факторов эволюционного процесса. Известно, что активное перемещение МГЭ индуцируется тепловым шоком. Система ответа на тепловой шок активируется не только повышением температуры, но и воздействием других весьма разнообразных внешних факторов: вирусным заражением клеток, обработкой ядами, детергентами, другими химическими факторами, нарушением энергетического обмена клеток и т.д. Все эти воздействия являются стрессовыми, неблагоприятными, а реакция системы теплового шока - генерализованной [39]. Кроме того, уровень транскрипции и транспозиций некоторых МГЭ индуцируются гамма-облучением, а также в определенных скрещиваниях, вызывая сложный набор изменений, который принято называть гибридным дисгенезом (редукция гонад, повышение частоты мутаций и модификаций, наличие рекомбинации у самцов) [31].
МГЭ подразделяют на три класса: ретротранспозоны, транспозоны и MITEs (III). Ретротранспозоны с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) осуществляют синтез нити ДНК на РНК-матрице. Такие МГЭ составляют примерно 2% генома дрозофилы. Ретротранспозоны по своей структуре неоднородны. Ретротранспозоны 1-го класса характеризуются рядом следующих свойств:
. Дисперсная локализация в геноме.
. Специфическая копийность от 4-8 копий на геном (например, gypsy) до 200 копий у Dm225.
. Харакртерный для каждого МГЭ размер (от 5 до 85 kb).
. Встраивание в хромосомы хозяина в форме провируса.
. Наличие в структуре длинных концевых повторов (LTR).
. Наличие двух открытых рамок считывания (ORF): gag-, которые имеют гомологию с геном gag ретровируса, кодирующего 3 белковых компонента нуклеотидной сердцевины вириона, и pol-, напоминающий вирусный ген pol, кодирующий белки, необходимые для транспозиции (протеаза, Pr, обратная транскриптаза, RT, РНК-аза Н, интеграза, Int). У некоторых МГЭ имеется 3-я рамка считывания, env, сходная с геном env, кодирующим гликопротеиновую оболочку вируса.
Ретротранспозоны класса 2 не имеют концевых повторов, содержат 2 открытые рамки считывания: первая, gag-подобный мотив, и вторая, эндонуклеазный домен, кодирует обратную транскриптазу и РНКазу H. Следствием дисперсной локализации МГЭ в геноме и их способности к траспозициям является высокий уровень их полиморфизма как по количеству общих сайтов (мест) внедрения в хромосомы, так и по числу стабильных мест посадки, характерных для каждой популяции и линии [23].
В отличие от ретротранспозонов, передвижение которых имеет в своём алгоритме синтез РНК из ДНК с последующим обратным ДНК из молекулы РНК, то есть метод «копировать и вставить», транспозоны передвигаются по геному способом «вырезать и вставить». Это осуществляется благодаря комплексу ферментов транспозазы. Информация об аминокислотной последовательности белка транспозазы закодирована в последовательности транспозона. Кроме того, этот участок ДНК может содержать другие, связанные с транспозоном последовательности, например гены или их части. Большинство ДНК-транспозонов имеют неполную последовательность. Такие транспозоны не являются автономными и передвигаются по геному благодаря транспозазе, которая закодирована другим, полным, ДНК-транспозоном. Транспозаза способна делать двухцепочные разрезы ДНК, вырезать и вставлять в ДНК-мишень транспозон [34].
Естественно, что после открытия нового класса генетических объектов, в частности, у дрозофилы, возник вопрос об их роли в геноме. Первоначально МГЭ считались «геномными паразитами», которые способны к самостоятельным автономным перемещениям в геноме, наследоваться вместе с другими генами генома и быть причиной инерционного мутагенеза [3]. До некоторого времени представление о МГЭ как об «эгоистической ДНК» оставалось доминирующим. Однако постепенно накапливались факты, свидетельствующие о том, что МГЭ выполняют в геноме определенные функции [19]. Так, МГЭ содержат разнообразные функциональные сайты знаки пунктуации и управления (промоторы, терминаторы, операторы, репликаторы, энхансеры, регуляторные сайты теплового шока [25], которые существенны для окружающих участков генома. Инсерции МГЭ в кодирующие зоны генов приводят к нарушению или резкому изменению их функций. Это связано с прямым нарушением генов и с влиянием знаков пунктуации (промоторов, терминаторов и др.) на процессы считывания. Доля таких мутаций особенно велика у прокариот, которые имеют высокую плотность кодирования информации в геноме [29]. Инсерции МГЭ в некодирующие области (спейсеры, интроны, фланговые участки др.) приводят к более "мягким" последствиям: усилению или ослаблению активности близлежащих генов, изменению их регуляции и т.п. Такие последствия преобладают у высших эукариот, у которых кодирующая часть генома составляет ~3-5%. Показано также, что среди видимых мутаций у дрозофилы и других объектов наиболее значительную долю составляют не замены нуклеотидов, а именно инсерции МГЭ [23].
В ряде своих работ Б. Мак-Клинток в 1984 г. продемонстрировала индукцию транспозиций ретротранспозонов у дрозофилы при помощи стрессовых температурных воздействий. В ранних работах Мак-Клинток было обнаружено, что условием вспышки транспозиций являются присутствие и определенное аллельное состояние второго регуляторного элемента [21]. Энгельс в 1989 г. показал, что транспозиции P-элемента дрозофилы индуцируются при определенном (дисгенном) скрещивании линий дрозофил, имеющих разный цитотип, но только в варианте ♀ M-цитотип × ♂ Р-цитотип. В ряде работ было показано, что индуцирующими факторами транспозиций МГЭ могут быть такие генетические процессы, как инбридинг, аутбридинг и изогенизация. Кроме того, в многочисленных селекционных экспериментах был продемонстрирован сопряженный ответ на отбор количественных признаков и рисунков локализации мобильных элементов [34].
Рассмотрим подробнее механизм индукции синдрома гибридного дисгенеза такими МГЭ, как Р- и hobo- транспозоны дрозофилы.
Р-элемент. Одним из первых исследованных и наиболее изученных у дрозофилы является мобильный Р элемент. Его размеры могут варьировать от 0,5 до 2,9 т.п.н. Различные линии мух обычно несут 50-60 копий этого элемента, и треть этих копий является полноразмерными. Для перемещения элемента in vivo необходимо наличие определённой последовательности длиной 150 п.н. на каждом конце транспозона. Встраивание этого элемента приводит к возникновению дупликации в 8 п.н. в участке ДНК, где он встраивается. Полноразмерный элемент имеет 4 открытых рамки считывания, или 4 экзона. В зародышевых клетках транскрипт включает все эти последовательности и продукт, считываемый с этой матрицы, является транспозазой, белком, который обеспечивает перемещение транспозона. В соматических клетках в белковом продукте последовательность 3-го интрона не представлена и этот белок является репрессором I типа. Тогда как белки, синтез которых обеспечивается неполноразмерными копиями Р элемента, называются репрессорами II типа [35].
Линии, не содержащие Р элемент называют линиями с М цитотипом. Линии, содержащие Р элемент, но не характеризующиеся в системе дисгенных скрещиваний достаточно высоким уровнем редукции гонад называют линиями с Q цитотипом. Линии же с наличием Р элемента и характеризующиеся уровнем редукции гонад от 10 до 100 % называют линиями с Р цитотипом. Выделяют также линии М’ цитотипа, которые имеют некоторое количество копий Р элемента, но в дисгенных скрещиваниях ведущие себя как М линии [22].
Линии D. melanogaster, собранные в природе до 1950 года (Америка) и до 1960 года в других популяциях мира и далее содержащиеся в лабораториях, как правило, не содержат Р элемента и, соответственно, характеризуются М цитотипом. Считается, что D. melanogaster была инфицирована этим МГЭ в средине прошлого столетия и этот элемент происходит из генома Drosophila willinstoni, обитавшей на Карибах и в Юго-восточной части Северной Америки. В последующие десятилетия этот мобильный элемент очень быстро распространился в популяциях D. melanogaster всего мира. Считается, что сегодня в мире не существует природных популяций D. melanogaster, геном которых был бы свободен от этого мобильного элемента [3].элемент. Транспозон hobo - ещё один мобильный элемент, способный вызывать синдром гибридного дисгенеза у дрозофилы и успешно колонизирующий представителей этого вида. Он принадлежит к суперсемейству мобильных элементов hAT [28]. Полноразмерная копия этого элемента состоит из около 3 т.п.н., включая инвертированные терминальные повторы в 12 п.н. Встраивание элемента hobo в сайт мишень приводит к образованию дупликаций в 8 п.н. Полноразмерный элемент имеет 2 открытых рамки считывания, одна из которых кодирует транспозазу, состоящую из 658 аминокислотных остатков, статус второй, расположенной выше и состоящей из 32 кодонов, до сих пор не ясен. hobo транспозаза отвечает не только за перемещение элементов, которыми кодируется, но и за активацию МГЭ других классов, например Hermes. Канонический hobo элемент содержит три ТРЕ повтора (треонин (Т), пролин (Р), глутаминовая кислота (Е)), состоящих из 9 п.н. каждый и кодирующих вышеуказанную последовательность аминокислот. Полагают, что предковый элемент имел 10 таких повторов. Большинство природных популяций D. melanogaster являются мономорфными и содержат hobo элемент с тремя ТРЕ. Однако существуют и полиморфные популяции, содержащие различное количество ТРЕ, они обнаруживаются только в Северной Европе, Южной Африке и Экваториальной Африке [26].