7.1. Биосенсоры

Биосенсоры – это измерительные устройства, в состав которых входит биологический элемент, специфически взаимодействующий с определяемыми молекулами.

Молекулы анализируемого вещества взаимодействуют с биомолекулярным элементом, расположенным (иммобилизованным) непосредственно на преобразователе (табл. 7.1). При этом взаимодействии генерируется поток электронов или изменяются физические свойства биомолекул, что преобразуется в электрический сигнал, который затем усиливается и выводится на индикатор.

Таблица 7.1

Биологические элементы и преобразователи

Окончание табл. 7.1

7.2. Биоэлементы

При действии ферментов происходит превращение молекул определяемого органического вещества. В среднем молекула фермента катализирует превращение приблизительно 100 молекул анализируемого вещества в секунду. При монослойном заполнении поверхности преобразователя молекулами фермента возможна генерация плотностью до 0,1 мА/см².

Применяемые в качестве биологических элементов клетки микроорганизмов или срезы тканей выполняют функции специфических биокатализаторов. Известен пример использования микроорганизмов в качестве биодатчиков. Предпринята попытка применить инфузории для определения токсичности жидких отходов (бульонов) рыбоперерабатывающего предприятия. Количественный учет инфузорий показал их нормальный рост и размножение в присутствии бульонов. Проверка действия на тетрахимену разрешенных антиокислителей и консервантов показала, что эти вещества в допустимых значениях концентрации не сдерживают рост и размножение инфузорий. Этот результат позволяет рекомендовать тетрахимену для определения токсичности жидких отходов. Сорбиновая кислота даже в разрешенном интервале значений концентрации вызывала гибель инфузорий. Механизм генерации сигнала при действии антител, рецепторов или биополимеров отличаются от действия ферментов. Этим биологическим элементам свойственно высокое сродство к определяемым молекулам, константы диссоциации образующихся комплексов достигают 10^–7–10^–14 моль/л. В результате такого сильного молекулярного взаимодействия меняются физические свойства биоэлемента, что преобразуется посредством преобразователя в электрический сигнал.

6.6.6. Метод протонного магнитного резонанса

Метод протонного магнитного резонанса (ПМР) обуслов-ливает его широкое применение для идентификации органических соединений и качественного анализа сложных смесей путем сравнения положения полученных сигналов с описанными в литературе. Кроме того, химические сдвиги протонов отдельных классов органических соединений можно рассчитать по эмпирическим аддитивным схемам, основанным на постоянном вкладе отдельных структурных элементов в экранирование протона. Следует отметить, что положение протонов гидроксильной и аминогруппы может изменяться в широких пределах. Это связано с их способностью образовывать водородные связи, в зависимости от окружения и прочности водородной связи экранирование протона может меняться.

Количественный анализ методом ПМР основан на прямой пропорциональности интегральной зависимости интенсивности сигнала от числа протонов при резонансной частоте ₀ и напряженности переменного магнитного поля H. Для количественного анализа смеси известных веществ необходимо, чтобы для каждого компонента смеси имелся неперекрывающийся характеристический сигнал; определение в этом случае можно проводить в одну стадию, используя однократную съемку спектра ПМР. Наиболее часто для количественных ПМР-определений используют метод внутреннего стандарта. Количественный ПМР-анализ особенно перспективен для определения смеси родственных соединений, поскольку вид ПМР-спектра меняется даже при незначительных изменениях геометрии молекулы и порядка связей. Последнее обстоятельство широко используют для установления структуры чистых органических соединений и структурных различий близких по строению соединений при исследовании конформационных превращений и изомеризации.

Таким образом, спектральные методы позволяют решить следующие важные вопросы аналитической химии:

– идентификацию органических соединений. Определение или подтверждение структуры (структурный анализ). Качественный анализ сложных смесей;

– количественное определение органических соединений в сложных смесях, как правило, с использованием внутренних стандартов.

Метод недеструктивный, позволяет проводить определение, используя один спектр; не требует предварительной градуировки;

– изучение динамического равновесия конформационных превращений, меж- и внутримолекулярных превращений и т. д.;

– исследование комплексообразования. Разрабатываются методы получения с помощью метода ЯМР реального двухмерного изображения объекта (ЯМР-интроскопия). Это является результатом съемки спектра ЯМР при наложении на образец градиента поля. Для улучшения соотношения сигнал–шум в приборах ЯМР используется импульсная спектроскопия Фурье.

7. Биологические методы

Биологические методы основаны на использовании биологических элементов, которые определенным образом взаимодействуют с определяемым веществом.

В целях расширения методов проведения анализа разработаны ферментные электроды для определения аминокислот, фенилаламина, глутамина, креатимина, аденозинмонофосфата, нитрата, салицилата, ацетилхолина, метионина, о-ацетилсерина и гистидина. Ферментные электроды с амперометрическим способом индикации имеют определенные преимущества над потенциометрическими сенсорами. Поскольку продукт ферментативной реакции расходуется на электроде, вступая в электрохимическую реакцию, следовательно, время отклика уменьшается.

Применение ЭПР для исследования комплексообразования парамагнитных ионов открывает большие возможности для решения многих вопросов химии координационных соединений: о способе координации лиганда, содержащего несколько донорских атомов; о числе и эквивалентности донорских атомов, входящих в состав внутренней координационной сферы (по числу линий СТО от лиганда); о различиях в составе комплексных соединений в твердом и жидком состояниях (по характеру спектров ЭПР при варьировании температуры). Кроме того, метод дает возможность непосредственного изучения:

– последовательного комплексообразования и определения количественных характеристик; исследования смешанно-лигандных комплексов (по изменениям в спектрах ЭПР при замене одного лиганда другим);

– координационных соединений в необычных степенях окисления (малоустойчивые соединения можно получать непосредственно в ячейке резонатора спектрометра).

Метод позволяет также оценить степень ковалентности связи в комплексных соединениях и изучить кинетику аналитических реакций.

Проблема зависимости характеристик биосенсоров от времени была рассмотрена теоретически. Однако предложенные объяснения оказались малопригодными для интерпретации экспериментальных данных.

Несмотря на большие возможности биосенсоры до сих пор не получили заметного распространения, и в большинстве случаев определение глюкозы по-прежнему ведется спектрофотометрическим методом. В развитых странах наблюдается большой подъем научно-исследовательских и конструкторских разработок в области создания БИУ. Можно с уверенностью сказать, что в будущем потребность в БИУ для контроля качества пищи возрастет.

7.4. Люминесцентный метод

Люминесцентный метод основан на явлении люминесценции, т. е. свойстве атомов и молекул выделять поглощенную ими энергию в виде потока квантов. Это явление имеет следующее теоретическое объяснение. Энергия любой молекулы или атома, находящихся в нор-мальном, равновесном состоянии, характеризуется определенным энергетическим уровнем. При облучении светом молекула поглощает часть энергии и в результате этого переходит на новый энергети-ческий уровень. После снятия облучения молекула самопроизвольно возвращается на прежний уровень, испуская при этом поглощенную порцию энергии. Это и вызывает свечение – люминесценцию. Из-за сложности своего строения молекула поглощает и испускает кванты энергии не одной определенной длины волны, а в некотором их интервале. Совокупность значений длины волны, вызывающих свечение вещества, называется спектром возбуждения. Молекулы обладают и спектром излучения, под которым понимается совокупность значений длины волны энергии, излучаемой люминесцирующим веществом. Иными словами, спектры возбуждения и излучения определяют границы активного поглощения и излучения, приводящего к возникновению свечения.

Каждое вещество имеет свои характерные спектры излучения, которые отличаются шириной и положением максимума интенсивности, что определяет цвет и интенсивность свечения. Меняя длину волны падающего света, можно найти ту область облучения, при которой начнут люминесцировать молекулы интересующего компонента исследуемой системы. Это позволяет применять люминесценцию для качественного анализа, который чаще всего основывается на самом факте возникновения или исчезновения свечения.

Для количественного анализа используют зависимость интенсивности свечения от концентрации в растворе анализируемого вещества. Однако эта зависимость имеет линейный характер только при малых значениях молярной концентрации – до 10^–7–10^–4 моль/л, что и определяет верхнюю границу диапазона измерений.

Сравнительно немногие вещества обладают люминесцентными свойствами в чистом виде. Однако номенклатура анализируемых этим методом веществ значительна за счет применения специальных реагентов, переводящих определяемый компонент в соединение, об-ладающее этим свойством.

Приборы, основанные на люминесцентном методе измерения, называются флуориметрами. Их устройство аналогично рассмотрен-ным выше спектрофотометрам.

Одним из главных преимуществ люминесцентного метода ана-лиза является высокая чувствительность – около 0,01 млн^–1. Погрешность измерения составляет от одного до нескольких процентов. Для флуориметров характерны те же источники погрешности, что и для спектрофотометров. Однако имеются и специфические погрешности, связанные с интенсивностью свечения, влиянием температуры и сопутствующих веществ, в том числе растворителя; на интенсивность свечения влияет и кислотность среды.

Применение люминесцентных методов весьма разнообразно. Интенсивным свечением обладают, например, канцерогенные вещества, многие гнилостные бактерии, что используется в биологии, медицине для анализа качества лекарств и пищевых продуктов. Например, жизнеспособные семена имеют желтую, а нежизнеспособные – коричневую люминесценцию. Очень полезным оказалось применение этих методов в археологии, криминалистике, судебной экспертизе.

В пищевой промышленности широко используется явление флуоресценции – разновидности люминесценции, в которой источником возбуждающего электромагнитного излучения служит ультрафиолетовый или видимый свет с длиной волны от 250 до 500 нм. Люминесценция предназначена для идентификации и количественного анализа витаминов, белков, жиров, углеводов и др.; для диагностики порчи овощей, плодов; обнаружения в продуктах питания консервантов, канцерогенных веществ; для определения сорта муки и наличия в ней примесей; для контроля всхожести семян и пр.

Несомненными достоинствами спектрального люминесцент-ного метода являются следующие: во-первых, анализ продуктов проводится без их разрушения, в отличие от химического, калориметрического, хроматографического и других методов, на основе собственной люминесценции ряда компонентов (например, ароматических аминокислот, витаминов, полиненасыщенных жирных кислот и т. п.); во-вторых, высокая чувствительность и точность. Спектрально-лю-минесцентные свойства органических молекул определяются в основном особенностями электронной структуры, так как именно от них зависит вероятность протекания тех или иных процессов в электронно-возбужденных молекулах.