Если исходить из традиционной концепции, то трудно объяснить тот факт, что даже при одинаковой степени инфильтрации СОЖ нейтрофилами, уровень генерации АФК в ней всегда выше при наличии хеликобактерной инфекции, чем в ее отсутствие [13].
Данные об активации нейтрофилов под действием НР также весьма противоречивы. Считается, что культура НР вызывает респираторный взрыв и генерацию АФК в нейтрофилах, выделенных от здоровых доноров [48]. Однако оказалось, что это обусловлено образованием в НР и секрецией им в окружающую среду хемотаксического пептида (fmlp), а хорошо отмытая культура НР не вызывает окислительного взрыва в нейтрофилах [27]. Клинические изоляты НР не вызывают респираторного взрыва и генерации АФК в гомологичных нейтрофилах (выделенных от тех же доноров). Другими словами, НР каким-то образом блокирует генерацию АФК в нейтрофилах своего хозяина. Это явление получило название специфического иммунопареза при хеликобактерной инфекции [30]. Оказалось, что НР обладает свойством блокировать высвобождение миелопероксидазы из первичных гранул нейтрофилов, а также блокировать глютен-зависимые системы антиоксидантной защиты в СОЖ [38]. Противоречивый характер носят и данные о взаимосвязи образования АФК в СОЖ со статусом НР по сagA. Отмечается как положительная корреляция, так и отсутствие корреляционной связи [43, 48]. Хотя считается, что наличие гена cagA в островке патогенности генома НР при водит к более сильному воспалительному ответу, однако, острое воспаление в СОЖ развивается и при инфицировании cagA-отрицательными штаммами НР.
Интересные данные были получены при совместном культивировании НР с эпителиальными клетками желудка. Оказалось, что в таких системах in vitro, т.е. в отсутствие нейтрофилов и макрофагов, наблюдается усиленное образование АФК [7]. Конечно, повышение при этом генерации АФК может быть обусловлено и активизацией ферментных систем эпителиальных клеток, как считали авторы этого исследования. Однако не следует забывать, что эти ферментные системы в эпителиальных клетках локализуются в митохондриях и эпителиальные клетки лишены механизмов для продукции АФК «на экспорт». Кроме того, при совместной инкубации культуры эпителиальных клеток желудка и НР, увеличение числа микробных тел в 10 раз, при одном и том же количестве эпителиальных клеток в этой закрытой системе, приводит к усилению генерации АФК в 1,5 раза [7].
Helicobacter pylori как эффектор окислительного стресса.
Расшифровка генетического кода НР показала, что этот микроорганизм является носителем генов, кодирующих широкий спектр ферментов окислительного метаболизма, таких как СОД, каталаза, нитроредуктаза, флаводоксиноксидоредуктаза [16]. (Рис.1.) В геноме штаммов НР с полностью расшифрованной структурой (26 695 и J99) нет генов, кодирующих НАДН-оксидазу. Однако в цитозоле микробных тел этих штаммов обнаруживается НАДФН-оксидазная активность [40], а у клинических изолятов и НАДН-оксидазная активность [41]. Эти ферменты, способны использовать в качестве субстрата не только НАДФН, но и другие акцепторы электронов [11]. При этом штаммы, резистентные к метронидазолу, проявляют низкую активность оксидазных ферментов, и как правило, несут мутации rdxA гена [44].
Рис. 1 В геноме H.pylori присутствуют гены, кодирующие синтез ферментов окислительного метаболизма (выделены)
Результатом активации дегидрогеназ НР является, с одной стороны - генерация энергетического потенциала, используемого микроорганизмом, а с другой стороны - образование АФК. Энергия окислительно-восстановительных реакций используется микроорганизмом для осуществления своих физиологических функций, в частности, для повышения устойчивости и выживания в агрессивных условиях внутрижелудочной среды и для нейтрализации цитотоксических факторов защиты макроорганизма. Однако одновременно они составляют и фактор патогенности самого микроба, так как образующиеся в этих реакциях АФК могут оказывать повреждающее воздействие на структуры СОЖ.
Наличие в геноме НР генов, кодирующих ферменты окислительного метаболизма, позволяло логически постулировать возможность генерации АФК самим микроорганизмом. Однако впервые на морфологическом уровне такая возможность была доказана в России в 1998 году [20, 21]. Существует специальная цитохимическая реакция, позволяющая электронномикроскопически визуализировать участки цитоплазматической мембраны, осуществляющей продукцию АФК. Это реакция с хлоридом церия (CeCl 3), которая использовалась ранее для выявления зон продукции АФК на мембране нейтрофилов при респираторном взрыве [31]. Ион церия, взаимодействуя с АФК в месте их образования, трансформируется в нерастворимую гидроокись церия, которая легко определяется в трансмиссионном электронном микроскопе в виде характерных электронноплотных депозитов. С помощью этого метода были изучены биоптаты СОЖ, взятые от больных хеликобактерным гастритом. Образование электроноплотных депозитов наблюдалось преимущественно на наружной мембране и жгутиковых структурах НР. (Рис. 2.) Не было обнаружено преципитатов на мембранах эпителиальных клеток СОЖ. Не удалось их обнаружить также и на мембранах нейтрофилов, в том числе и тех, которые содержали фагоцитированные микробные тела. Последнее может рассматриваться как морфологическое проявление специфического иммунопареза, о котором говорилось в работе Норгарда [30]. Конкретные механизмы такого специфического иммунопареза не известны.
Рис. 2 Электронноплотные депозиты гидроокиси церия на поверхности наружной мембраны и жгутиковых структур (стрелка) H.pylori.На мембране эпителиальных клеток желудка депозиты отсутствуют (двойные стрелки). Трансмиссионная электронная микроскопия
Таким образом, результаты ультраструктурного цитохимического исследования убедительно продемонстрировали, что мембранные структуры НР являются непосредственным источником образования АФК в СОЖ при хеликобактерном гастрите.
В том же 1998 году японскими авторами с использованием метода биохемилюминесценции впервые было показано, что бактериальная культура НР может генерировать супероксидный радикал [28]. Независимо от этих данных, в России были разработаны методы выявления люминолзависимой хемилюминесценции бактериальной суспензии НР и проводилось изучение продукции АФК на референсных штаммах НР и клинических изолятах в различных условиях окружающей среды in vitro [23, 24, 25].
Оказалось, что способность к продукции и динамика выброса АФК у разных штаммов существенно различаются. Есть штаммы с высокой продукцией АФК, а есть такие, которые их практически не генерируют. (Рис. 3.) Кстати, родственные хеликобактеру бактерии - Campylobacter jejuni также не генерирует АФК [22]. Кроме того, изменение микроэкологических характеристик популяции НР в процессе роста культуры также влияют на динамику продукции АФК. Если брать суммарную продукцию АФК, то она максимальна у 72 ч культуры, а затем несколько снижается, продолжая оставаться на высоком уровне. При этом 72 ч культура дает более быстрый, но скоро затухающий выброс АФК, чем 48 ч культура. С увеличением возраста культуры амплитуда выброса АФК снижается, однако длительность продукции АФК возрастает. (Рис. 4.)
Рис. 3 Межштаммовые различия временной динамики продукции (а) и суммарного количества АФК (б) в суспензии H.pylori
Рис. 4 Временная динамика продукции АФК в культуре H.pylori различного возраста (клинический изолят 189)
При сопоставлении уровня продукции АФК с морфологией бактерий в культуре, было обнаружено, что при старении культуры НР в ней резко уменьшается количество вегетативных форм МО и возрастает количество кокковых форм, которые считаются нежизнеспособными, некультивируемыми. Однако, даже у кокковых форм НР активность окислительных ферментов очень высока [23]. Более того, самого высокого уровня продукция АФК in vitro достигается в ходе бациллярно-кокковой трансформации, когда в культуре НР в равных количествах представлены бациллярные и кокковые формы микроорганизма (Рис. 5.). Процесс бациллярно-кокковой трасформации in vitro инициируется истощением питательной среды и ухудшением в связи с этим условий микроокружения в растущей культуре. Как известно, реакции бактериальных популяций на неблагоприятные воздействия весьма стереотипны. Поэтому можно полагать, что популяции НР, присутствующие в организме хозяина in vivo будут реагировать также - т.е. трансформируясь в кокковые формы. Уже доказано, что количество кокковых форм возрастает и в ходе антибактериальной терапии [3, 4]. Это весьма существенно, так как любое ухудшение условий обитания НР в желудке (неудачная попытка эрадикации или прием антибиотиков по поводу интеркурентных заболеваний) создает опасность активации окислительных ферментов микроорганизма с усилением генерации АФК в СОЖ. По данным японских авторов кокковые формы НР значительно чаще и в большем количестве встречаются при раке желудка, чем при язвенной болезни [10].
Рис. 5 Высокая активность окислительного метаболизма в кокковых формах клинического изолята №189 H.pylori: а)суммарная продукция АФК в культуре различного возраста. б)соотношение бациллярных (?) и кокковых (¦) форм в культуре различного возраста
Интересна взаимосвязь окислительно-восстановительных ферментов НР с уреазой - одним из основных конституциональных ферментов НР, с помощью которой он противостоит кислотно-пептическому фактору желудочного сока. Метаболизируя мочевину, этот фермент приводит к повышению уровня рН в микроокружении НР. Взаимодействие двух ферментных систем может заключаться в совместной регуляции электрохимического градиента для оптимизации физиологических процессов в микроорганизмах и повышения их адаптационных свойств. Было доказано, что продукты взаимодействия двух этих ферментных систем - соединения типа монохлорамина (NH2Cl), в большей степени, чем их предшественники (NH3 и HOCl), обладают свойством повреждать ДНК [42]. Высокая токсичность хлорамина обусловлена его способностью вызывать пероксидацию и растворение мембран. Взаимодействие этих ферментных систем позволяет микроорганизму перекрывать большой диапазон изменений рН в своем микроокружении. В условиях кислой среды работает уреаза, ощелачивая среду, тогда как оксидазы не работают. Но щелочные значения рН губительны для НР, поэтому при значениях рН > 6, включаются в работу оксидазные ферменты микроорганизма. Результатом их работы является генерация свободного протона, закисляющего микросреду (НР пытает удержать рН в области оптимальных для себя значений), но, с другой стороны, при этом продуцируются АФК - которые могут повреждать окружающие ткани, нарушать процессы их обновления, нарушать генетическую целостность, вызывая перестройки в ДНК соматических клеток, и таким образом индуцировать карциногенез. Повышенный риск развития рака желудка при увеличении внутрижелудочного рН > 4 обусловлен также и менее эффективным в таких условиях функционированием антиоксидантных систем и более активным накоплением в СОЖ пероксинитритов, образование которых катализируется бактериальными ферментами НР [49].
Окислительное повреждение тканей можно выявить, определяя с помощью иммуно-гистохимического метода содержание нитротирозина (индуцированного пероксинитритом) - маркера окислительного повреждения тканей. Оказалось, что при хеликобактерном гастрите окислительное повреждение выявляется в поверхностном эпителии, в собственной пластинке и главное -в шеечном эпителии желудочных желез [33]. Шеечный эпителий это камбиальная зона - зона локализации стволовых клеток - источник клеточного обновления СОЖ. Так вот именно оно является местом выраженного окислительного повреждения при хроническом хеликобактерном гастрите. Известно также, что это излюбленное место адгезии НР. После успешной эрадикации нитротирозин в шеечном эпителии СОЖ не определяется.
Присутствие НР в СОЖ при хеликобактерном гастрите приводит к разбалансировке процессов апоптоза и пролиферации эпителиальных клеток. Было установлено, что совместное культивирование эпителиальных клеток желудка и НР in vitro приводит к замедлению роста клеток, фрагментации ДНК и усилению апоптоза [45]. Усиление пролиферативной активности СОЖ под действием НР опосредовано через повышение уровня сывороточного гастрина, а непосредственным следствием действия НР на СОЖ является усиление в ней процессов апоптоза [34]. В апоптоз, как известно, в первую очередь уходят клетки с необратимыми повреждениями ДНК. Существенно, что усиление апоптоза эпителиальных клеток желудка наблюдается не только in vivo, но и на культуре эпителиальных клеток желудка in vitro, (то есть в отсутствие воспалительной реакции и нейтрофилов, способных генерировать АФК). Следовательно, в этом процессе задействованы АФК, продуцируемые самим микроорганизмом.
Усиление процессов апоптоза в В-лимфоцитах СОЖ, показывает, что лимфоидные клетки также являются объектом мутагенной активности продуктов жизнедеятельности НР. Следствием этого является известная способность НР провоцировать развитие лимфом в СОЖ [35]. Своевременно проведенная антихеликобактерная терапия приводит к их обратному развитию.
Клиническое значение окислительно-восстановительного метаболизма НР пока не осознается в полной мере [19]. Между тем, оно весьма существенно и включает в себя два аспекта. В настоящее время установлена несомненная взаимосвязь между статусом резистентности штаммов НР к метронидазолу и уровнем активности в них НАДФН оксидазы [41]. Последние данные свидетельствуют о том, что это не просто случайное выпадение функции одного фермента, а результат мутации гена rdxA, регулирующего экспрессию целого ряда дегидрогеназных ферментов в НР [11].
Другой аспект связан с высокой мутагенной активностью АФК. Образование даже небольших количеств супроксидного аниона, гидроксильного радикала, гипохлоритов и пероксинитритов вблизи камбиальной зоны СОЖ создает микроокружение, способствующее канцерогенезу. Не исключено, что с различиями в способности штаммов НР генерировать АФК связаны и различия в их способности индуцировать канцерогенез. Если перефразировать известное высказывание американского хеликобактериолога Давида Грехема о том, что «хороший НР это только мертвый НР», то с учетом уровня активности окислительных ферментов все же есть «хороший» НР (где их мало) и есть «плохой» НР - с высоким уровнем продукции АФК. Соответственно и риск развития рака желудка при инфицировании различными штаммами также будет различным.