Центральный НИИ гастроэнтерологии
Helicobacter pylori - индуктор и эффектор окислительного стресса в слизистой оболочке желудка: традиционные представления и новые данные
С.Г. Хомерики
Почти четверть века понадобилось мировой медицинской общественности, чтобы заслужено оценить выдающуюся значимость открытия Б. Маршала и Р. Уоррена. Долгий путь сомнений и поисков был вознагражден в 2005 году присуждением этим ученым Нобелевской премии за установление этиопатогенетической роли Helicobacter pylori (HP) в развитии хронического гастрита и язвенной болезни. Однако это событие нельзя рассматривать как завершающий этап долгой истории. Оно только подстегнуло интерес к этой бактерии, которая под натиском все возрастающего числа её исследователей продолжает раскрывать свои тайны.
Всемирная Организация Здравоохранения относит НР к канцерогенам 1 группы [17]. Канцерогенные свойства НР доказаны множеством эпидемиологических и экспериментальных исследований [8] Между тем, ни один из известных в настоящее время факторов патогенности НР (CagA, VacA и др.) изолированно не обладает канцерогенным действием [18, 36], а в конкретных механизмах участия НР в желудочном канцерогенезе еще много неясного.
Одним из наиболее интересных направлений изучения воздействия НР на слизистую оболочку желудка (СОЖ) является участие этого микроорганизма в активации окислительного метаболизма. Это один из важнейших механизмов, ведущих к повреждению эпителиального барьера. С помощью окислительно-восстановительных реакций осуществляется энергетическое обеспечение жизнедеятельности клеток и регуляция клеточного цикла. Продукты окислительно-восстановительных реакций, воздействуя на уровне ферментных систем и генов-регуляторов, активируют клеточную пролиферацию, усиливают процесс запрограммированной клеточной гибели - апоптоз и повреждают носительницу генетической стабильности клетки - ДНК [50]. Нерепарируемые повреждения ДНК - мутации во много раз повышают вероятность развития злокачественных опухолей в СОЖ.
Системы генерации активных форм кислорода.
Без окислительно-восстановительных реакций невозможна жизнедеятельность клеток. В живых организмах существуют четыре основные группы прооксидантных ферментных систем, продуцирующих молекулы активных окислителей, способных вызвать неферментное окисление органических субстратов. Это ферментные системы генерирования супероксид-аниона (О2-.), ферменты, образующие перекись водорода (Н2 О2), а также ферменты, синтезирующие гипохлорную кислоту (НОCl) и окись азота (NO). В процессе этих реакций в клетках постоянно образуются активные формы кислорода (АФК), такие как кислород-содержащие радикалы - супероксид-анион (О2-.), гидроксильный радикал (ОН.), гипохлорит-анион (ОCl.), а также короткоживущие соединения - Н2 О2 и НОCl. Последние способны в присутствии ионов двухвалентного железа быстро разлагаться с образованием гидроксильных радикалов (реакция Фентона, реакция Хабера-Вайса).
Н2 О2 + Fe2+ > HO. + OH- + Fe3+ (реакция Фентона)
Fe2+
Н2 О2 + О2-. > HO. + OH- + О2 (реакция Хабера-Вайса)
Образование супероксид-аниона происходит благодаря активности мембранных ферментов НАДН-оксидазы или НАДФН-оксидазы, способствующих окислению восстановленных субстратов (НАДН или НАДФН). Активированные оксидазы катализируют кислород в супероксид-анион, который через ряд промежуточных реакций генерирует гидроксильный радикал, гипохлорную кислоту и хлорамин. Гидроксильный радикал из-за своей высокой реактогенности не может диффундировать в тканях и действует непосредственно в местах своего образования.
Супероксид-анион может являться также продуктом активности ксантин-оксидазы, генерирующей его из молекулы кислорода и ксантина с образованием мочевой кислоты. Большие количества перекиси водорода образуются под действием фермента моноаминоксидазы, локализующейся на наружной поверхности митохондриальных мембран.
Окись азота (NO), образуется при окислении L-аргинина под действием кальций-зависимых конститутивных и кальций -независимых индуцибельных NO-синтетаз. При взаимодействии NO с супероксид-анионом образуется сильный окислитель - пероксинитрит (NO2).
Гидроксильный радикал, взаимодействуя с молекулами ненасыщенных липидов (LH), образует липидные алкильные (L. ), гидропероксидные (LOOH) и алкосильные (LO.) радикалы. В биологических системах постоянное образование липидных радикалов инициирует окисление новых молекул субстрата по типу цепной реакции, что ведет к нарушению структуры липидного слоя биологических мембран.
В подавляющем большинстве соматических клеток образование АФК происходит в специализированных цитоплазматических «энергетических фабриках»- в митохондриях, в незначительных количествах, необходимых для покрытия энергетических нужд клеток. Лишь некоторые типы клеток могут генерировать АФК в большом количестве, способном вызвать цитотоксический эффект. Это клетки защитных систем организма, такие как нейтрофилы, макрофаги, некоторые субпопуляции лимфоцитов (Т-киллеры). Именно продукцией АФК обусловлена цитотоксическая активность этих клеток. Нейтрофилы являются основным источником АФК, генерируемых «на экспорт» во внутренние среды организма. В норме нейтрофилы находятся в крови в неактивном состоянии. При стимуляции нейтрофилов активируются оксидазы плазматической мембраны, которые запускают серию метаболических реакций, характеризуемых как «респираторный взрыв». Этот термин отражает быстрое изменение метаболизма нейтрофилов с активацией внутриклеточной миелопероксидазы, увеличением потребления и окислением глюкозы, ростом поглощения кислорода и генерацией АФК: супероксид-анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала и синглетного кислорода. В течение секунд после активации нейтрофилов уровень продукции АФК в них увеличивается более чем в 100 раз. Активация миелопероксидазы приводит к образованию гипохлорной кислоты (НОCl), которая и обеспечивает основное бактерицидное действие нейтрофилов.
АФК весьма токсичны для клеточных мембран и коллагеновых волокон, способны разрушать свободные аминокислоты (цистеин и лизин). В повреждении клеточных мембран могут играть важную роль не только первичные, но и вторичные продукты свободнорадикального окисления липидов, такие как малоновый диальдегид (МДА). Альдегидные группы при этом вступают в реакцию с аминогруппами белков и нуклеотидов с образованием прочных межмолекулярных связей, нарушающих нормальное функционирование молекул биополимеров [14]. При усилении перекисного окисления липидов происходит подавление гликолиза, разобщение окислительного фосфорилирования, подавление синтеза белка и нуклеиновых кислот, инактивация микросомального цитохрома Р450, подавление активности других мембранно-ассоциированных ферментов.
Системы антиоксидантной защиты.
При таком мощном повреждающем воздействии АФК на биомембраны и молекулы жизненно важных биополимеров, существование последних было бы невозможно без наличия в организме регуляторных механизмов, ограничивающих накопление в тканях этих высокотоксичных соединений. В процессе эволюции клетками были выработаны специальные защитные механизмы для внутриклеточной нейтрализации АФК на различных биохимических уровнях.
Первый уровень защиты предусматривает возможность обезвреживания потенциально опасных АФК с участием внутриклеточной супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, что предотвращает образование гидроксильного радикала при протекании реакций Фентона и Хабера-Вайса. СОД осуществляет восстановление супероксид аниона до менее активной формы - перекиси водорода, а каталаза расщепляет перекись водорода с образованием воды и молекулярного кислорода.
Второй уровень защиты предусматривает обезвреживание генерируемых липидных радикалов путем взаимодействия с природным антиоксидантом б-токоферолом (витамин Е)[32]. Это соединение функционирует как «ловушка радикалов», перехватывая неспаренный электрон у липидных радикалов с образованием феноксильного радикала самого б-токоферола, который значительно менее активен и быстро регенерирует либо с участием экзогенной аскорбиновой кислоты, либо в реакциях с эндогенным убихиноном Q10. Липидные радикалы могут связываться также с другим природным антиоксидантом - провитамином А (в-каротин), который являясь полиненасыщенным соединением легко окисляется по радикальному механизму, однако конкретные механизмы антирадикального действия в-каротина еще до конца не выяснены [1]. К природным антиоксидантам относятся также полифенолы растительного происхождения (флавоноиды) и гидроксинафтохиноны животного происхождения (витамин К) [12]. Особенность их антиоксидантного действия заключается в том, что они могут инактивировать не только липидные радикалы, но и супероксид-анион (т.е. участвуют и в первом уровне защиты).
Третий уровень защиты, препятствующий накоплению АФК, связан с функционированием глютатион-зависимых ферментов - глютатионпероксидазы и глютатион-S-трансферазы. Селен-содержащие глютатионпероксидазы катализируют реакцию восстановления глютатионом нестойких липидных гидропероксидов в стабильные соединения [26]. Они также способны утилизировать перекись водорода и пероксинитрит, участвуя в защитных механизмах первого уровня [39].
Следует подчеркнуть, что с химической точки зрения антиоксидантами являются вещества, способные непосредственно взаимодействовать с АФК с образованием малореакционноспособных продуктов, хотя ход окислительно-восстановительных реакций может быть существенно замедлен либо блокирован веществами, не взаимодействующими с АФК (например, связывающими двухвалентное железо). Однако в биологических системах термин «антиоксидантная активность» трактуется шире и включает все биохимические воздействия, замедляющие скорость протекания окислительно-восстановительных реакций. Очевидно, что существование сложной многоуровневой системы антиоксидантной защиты в физиологических условиях сводит до минимума опасность бесконтрольного протекания свободнорадикальных процессов в клетке.
Что такое «окислительный стресс»?
В отсутствие патологических процессов в СОЖ отмечается сбалансированная деятельность ферментативных систем, генерирующих АФК и систем антиоксидантной защиты. К сожалению, суммарная мощность эндогенных антиоксидантных систем в СОЖ значительно ниже, чем, например, в ткани печени. Большая часть ферментативной активности при этом связана с эпителиальными клетками, тогда как собственная пластинка слизистой оболочки почти лишена антиоксидантной защиты [49]. Развитие многих заболеваний пищеварительной системы сопровождается усиленным образованием в органах АФК [2, 5, 6, 19, 38]. Если это сопровождается адекватным усилением функционирования систем антиоксидантной защиты, то не происходит избыточного накопления в тканях АФК и вторичных продуктов перекисного окисления липидов. Лишь в том случае, когда это равновесие нарушается, возникает окислительное повреждение тканей. Это может быть обусловлено как чрезмерным образованием АФК (за счет эндогенных либо экзогенных источников), так и подавлением функции эндогенных антиоксидантных систем и при недостаточном поступлении экзогенных антиоксидантов. Нарушение баланса между образованием АФК и их утилизацией, ведущее к избыточному накоплению в тканях продуктов перекисного окисления липидов и называется окислительным стрессом. Из заболеваний пищеварительной системы, при которых местные и общие проявления окислительного стресса наиболее наглядны, можно назвать острый и хронический панкреатиты, язвенную болезнь, хеликобактерный гастрит. Несмотря на этиопатогенетические и клинические различия, их объединяет усиление продукции АФК, усиление перекисного окисления липидов, активация, а затем быстрое истощение систем антиоксидантной защиты тканей.
К биохимическим проявлениям окислительного стресса относят повышение в крови уровня супероксидных радикалов и уровня МДА (как проявление увеличения активности перекисного окисления липидов), снижение содержания аскорбиновой кислоты, повышение уровня фосфолипазы А2 и эластазы сегментоядерных лейкоцитов. Возрастают показатели хемилюминесценции нейтрофилов, что свидетельствует об усилении генерации ими АФК. Активация ферментов антиоксидантной защиты - СОД, каталазы, глютатионпероксидазы, наблюдается в начальных стадиях заболевания, а затем активность их быстро падает. В тканях падает концентрация восстановленного глютатиона и накапливается его окисленная форма [9, 46].
При отсутствии фармакологической коррекции проявления дисбаланса систем генерации АФК и антиоксидантной защиты сохраняются около 6 месяцев от начала заболевания. Своевременное выявление признаков окислительного стресса позволяет, путем назначения экзогенных антиоксидантов, нормализовать окислительно-восстановительный баланс в течение 24 суток [2]. желудок окислительный стресс слизистый
Helicobacter pylori как индуктор окислительного стресса.
Уже давно было известно, что у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки наблюдается активация перекисного окисления липидов с повышением в крови и в СОЖ уровня диеновых конъюгатов и МДА, а также АФК [6]. У больных с хроническим хеликобактерным гастритом также было отмечено усиленное образование АФК в СОЖ [13, 15]. Однако до сих пор нет единого мнения об источниках АФК в СОЖ при хеликобактерной инфекции. Большинство исследователей считает, что источником АФК в СОЖ являются инфильтрирующие ее нейтрофилы и макрофаги. Другие полагают, что источником АФК могут быть клетки эпителия желудка. В настоящее время широко распространено мнение, что НР лишь запускает «включает» механизмы генерации АФК клетками хозяина, а при длительной персистенции в СОЖ постоянно «подстегивает» защитные механизмы макроорганизма, клетки которого в основном и генерируют АФК.
НР, попадая в организм, адгезируется на апикальной поверхности эпителиальных клеток. Выделяемые им при этом патогенные факторы, в частности белок CagA, транспортируются в эпителиальные клетки и индуцируют спектр внутриклеточных изменений, включая реорганизацию актина цитоскелета, угнетение секреции мукоида, повышение экспрессии гена, кодирующего синтез провоспалительного цитокина - интерлейкина-8 (IL-8). Усиление синтеза и секреции провоспалительных цитокинов (IL-8, MCP-1), являющихся сильными хемоаттрактантами для нейтрофилов и моноцитов, приводит к усилению инфильтрации слизистой оболочки желудка этими клеточными элементами. Развивается острое воспаление, характерное для активного хеликобактерного гастрита. Ведущим активатором нейтрофилов является HP-NAP (HP neutrophil activaiting protein). Он запускает выработку нейтрофилами CD11b и CD18, которые облегчают ICAM-1-зависимую (Intercellular adhesion molecule-1) адгезию нейтрофилов к эндотелию и их экстравазацию. Кроме того, привлеченные к участку инфекции нейтрофилы сами становятся источниками воспалительных цитокинов, производя не только IL-8, но и IL-1в, и TNF-б, еще более усиливая клеточный ответ на инфекцию. Активированные нейтрофилы и макрофаги в большом количестве генерируют АФК, что приводит к мобилизации антиоксидантных защитных систем в слизистой оболочке желудка [29]. При этом в ней снижается уровень содержания аскорбиновой кислоты [37], уменьшается содержания восстановленного глютатиона, что свидетельствует о снижении активности антиоксидантной системы, а увеличение уровня МДА - об усилении перекисного окисления липидов с повреждением мембранных структур клеток [38]. Известно, что, после того, как спадает активность острого воспалительного процесса и гастрит переходит в хроническую фазу, в составе клеточного инфильтрата собственной пластинки слизистой оболочки резко снижается количество нейтрофилов и макрофагов и инфильтрат представлен в основном лимфоцитами и плазмоцитами, тогда как уровень генерируемых в СОЖ АФК остается высоким. При этом, уровень генерации АФК в слизистой оболочке антрального отдела желудка, определяемый по уровню люминолзависимой хемилюминесценции, четко коррелирует со степенью его микробной обсемененности [47]. Успешная эрадикация НР приводит к достоверному снижению продукции АФК в СОЖ, тогда как неудачная попытка эрадикации не дает такого эффекта [15].