6. Мікробіологічний контроль

6.1.Методика змиву з поверхні

Для визначення санітарано–мікробіологічного стану поверхонь приміщень та обладнання проводять змив з поверхні відповідної площі. Змив здійснюється, за допомогою простерилізованого в розчині спирту етилового трафарету із заданою площею рамки (100 см²).

Трафарет прикладається до відповідної контрольованої ділянки поверхні; далі стерильним та змоченим у воді дистильованій тампоном проводять змив з поверхні. В стерильних умовах – біля полум’я спиртівки, вносять тампон у колбу з водою дистильованою, занурюючи його повністю.

Після цього стерильною піпеткою відбирають відповідний об’єм води із колби та переносять пробу у чашку Петрі з поживним середовищем. Інкубацію проводять при температурі 37 °C впродовж 2 діб. Після чого підраховують кількість КУО відповідно враховуючи всі площі поверхонь.

6.1. Ідентифікація штаму-продуцента

Ідентифікація Е. сoli здійснюється шляхом відбору проб кожну годину після початку вирощування посівного матеріалу та виробничого біосинтезу.

Культуральну рідину, об’ємом 0,1 мл відбирають на предметне скло та готують препарат «роздавлена крапля». Після цього проводять мікроскопіювання зразка. При цьому Е. сoli має такі морфолого–культуральні ознаки: клітини дрібні, палочкоподібної форми; за Грамом фарбуються негативно; неспороносні; мають розмір 1×3,5 мкм; рухливі; мають добре помітні тільця включення після індукції синтезу гібридного білка; край колонії рівний, діаметр колоній 1–3 мм.

Одним з методів ідентифікації мікроорганізму, являється метод висівання даного штама–продуцента на диференційно–діагностичне поживне середовище. Для ідентифікації продуцента Е. coli JM109/pPINS07 використовується поживне середовище Ендо наступного складу:

- живильний агар сухий – 26,5 г;

- ЕКДА – 1,22 г;

- динатрію гідрофосфат – 0,48 г;

- натрію сульфіт безводний – 0,83 г;

- натрію карбонат – 0,03 г;

- лактоза – 10,7 г;

- фуксин основний – 0,23 г;

- вода очищена – 1000 мл [24].

Відбирають культуральну рідину, об’ємом 0,1 мл та засівають нею підготовлене поживне середовище в чашці Петрі; інкубують впродовж 18 годин при температурі 36 °С. Ріст характерних малинових колоній з металевим блиском або без нього або рожевих колоній, діаметром від 2 до 4 мм вказує на те, що мікроорганізм, який інкубувався є Е. coli.

6.3. Показники росту і синтезу цільового продукту

6.3.1. Концентрація біомаси

Контроль концентрації біомаси здійснюють методом спектрофотометрії, яка заснована на вивченні спектрів поглинання в різних областях спектра.

Випробовуваний розчин: 1 мл культуральної рідини.

Приготування зразка препарату: 1 мл чистого посівного матеріалу (клітини штаму–продуцента) вносять в поліпропіленову пробірку місткістю 50 мл, додають 49 мл чистого поживного середовища.

Наповнюють стандартну кювету (довжина оптичного шляху 10 мм) чистим поживним середовищем (відібраним перед засівом). При довжині хвилі λ=600 нм, корегуюють значення оптичного поглинання середовища як базове.

Наповнюють кювету досліджуваним зразком культуральної рідини та вимірюють оптичну густину при довжині хвилі 600 нм. ять

Вимірювання проводять кожну годину після початку виробничого біосинтезу. Біосинтез вважається завершеним, коли значення вимірюваної оптичної густини становить до 10 одиниць.

6.3.2. Концентрація цільового продукту Визначення гібридного білка методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (пааг)

Електрофорез проводять з використанням електрофоретичної системи Fisher Scientific, Dual Gel Protein Electrophoresis System, Model FB–VE20–1 при постійному струмі (135 В, 0,03 A).

Приготування зразка для електрофоретичного аналізу:

Необхідно внести 100 мкл розчину гібридного білка в мікроцентрифужну пробірку та осадити клітини центрифугуванням, з прискоренням 10000 g протягом 1 хвилини. Далі злити супернатант, клітини ресуспендувати в 50 мкл буфера (100 мM Tris–HCl (pH 6,8), 200 мM β–меркаптоетанолу, 1 % SDS; 20 % гліцерин; 0,01 % бром феноловий синій). Зразок помістити на 5 хвилин в киплячу водяну баню, після чого центрифугувати протягом 5 хв при значенні прискорення – 10000 g.

Приготування електрофоретичної пластини:

готують гелеві пластини згідно інструкції фірми виробника.

Необхідно приготувати 30 мл розчину для розділюючого гелю наступного складу: 15 % акриламід; 0,4 % біс–акриламід; 375 мM Tris–НCl (pH 8,8); 0,1 % SDS; 0,1 % персульфат амонію (PSA); 0,08 % TEMED. Розчин ТЕМЕD вноситься безпосередньо перед заливанням розчину між гелевими пластинами як каталізатор полімеризації акриламіду.

Далі поміщають приготований розчин між гелевими пластинами та залишають на 15–20 хвилин до повної полімеризації гелю.

Встановлюють гребінку між гелевими пластинами та вносять приготований розчин. Після полімеризації концентруючого гелю видаляють

гребінку та промивають сформовані комірки водою.

Проведення електрофоретичного розділення:

Встановлюють гелеву пластину в камеру електрофоретичної системи та заповнити камеру буфером для електрофорезу: 25 мM Tris; 250 мM гліцин; 0,1 % SDS. Внесять в комірки приготовані зразки гібридного білка та зразок маркера білків різної молекулярної маси. Підключають камеру до джерела струму. Проводять електрофоретичне розділення до досягнення бромфеноловим синім краю гелевої пластини.

Візуалізація гібридного білка на гелі:

Розділяють гелеві пластини та обережно перенесять гель в контейнер, що містить розчин для фарбування: 45 % метанолу; 10 % кислоти оцтової; 0,25 % барвника Coomassie Blue R250. Інкубують щільно закритий контейнер в термостаті (60 °С) протягом 1 години.

Після фарбування відмивають гель до знебарвлення фону розчином 5 % метанолу; 7 % кислоти оцтової. Проводять детекцію гібридного білка, що повинен складати найбільш інтенсивну забарвлену зону на рівні молекулярної маси 12 кДа. хїїїїї

Визначення концентрації білка методом Бредфорда

Приготування розчину Бредфорду:

В 840 мл води внесять 100 мг барвника Coomassie Blue G–250 (0,01 %), 59 мл 95 % етанолу (4,7%), і 100 мл 85 % ортофосфорної кислоти (8,5 %). За допомогою магнітної мішалки перемішують до повного розчинення кристалів барвника Coomassie Blue.

Отриманий розчин фільтрують через Whatman 3M фільтр, щоб звільнитися від нерозчинених частинок. Розчин можна зберігати протягом двох тижнів при кімнатній температурі. Альтернативно можна використовувати комерційний розчин Бредфорда виробництва Sigma або Merck.

Побудова калібрувальної кривої:

- на аналітичних вагах зважують 10 мг інсуліну людини;

- перенесять наважку інсуліну людини в мірну колбу, місткістю 10 мл;

- вносять в колбу 5 мл 0,1 М кислоти хлористоводневої, перемішують

до повного розчинення білку. Внесять в колбу 5 мл 1 М фосфатного буферу;

- необхідно приготувати в окремих мікропробірках по 200 мкл розчину інсуліну, що містить: 0 мкг, 2 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг, 30 мкг, 50 мкг білку по наведеній схемі (табл. 6.2):

Таблиця 6.2

Приготування досліджувальних розчинів інсуліну

- вносять в кожну мікропробірку 1 мл розчину Бредфорда, закривають

пробірки і перемішати. Вимірювання проводять при довжині хвилі 595 нм, через 10 хвилин після перемішування. Отримані результати використати для побудови калібрувальної кривої.

Приготування зразка:

1 мл досліджуваного розчину вносять в мірну колбу місткістю 10 мл, довести до мітки водою очищеною. В мікропробірку вносять 197 мкл води і 3 мкл приготованого розчину, перемішати і використати для визначення концентрації гібридного білка (С, мкг/мл).

Вносять в мікропробірку 1 мл розчину Бредфорда, закривають пробірку і перемішують. Вимірювання проводять при довжині хвилі 595 нм, через 10 хвилин після перемішування. Для встановлення нульового значення базового поглинання необхідно змішати в пробірці 1 мл реактива Бредфорда з 200 мкл води. Значення оптичної густини повинно бути від 0,1 до 1,0. Після вимірювання промити кювету 70 % розчином етанолу.

Визначають концентрацію гібридного білка за калібрувальною кривою. Концентрація відновленого гібридного білка (С_v) розраховується по формулі:

С_v= (С×0,2×10⁴)/ 3×10³, (6.1)

де С – концентрація гібридного білка, мг/мл.

Отриманий результат помножити на об’єм гібридного білка (в літрах) – для отримання маси відновленого білка (в грамах).

Визначення вмісту рефолдованого гібридного білку методом верх

Приготування випробуваних розчинів: 2 проби рефолдованого гібридного білка по 1 мл розчину без розведення; 1 мл розчину вносять в мірну колбу місткістю 10 мл, доводять до мітки водою очищеною.

Приготування рухомої фази А:

1350 мл буферного розчину з рН 2,3 поміщають в мірну склянку місткістю 2000 мл і додають 150 мл ацетонітрилу. Після змішування доводять рН рухомої фази до значення 2,3 (потенціометр) кислотою ортофосфорної концентрованою.

Термін придатності рухомої фази 1 місяць.

Приготування рухомої фази Б

600 мл буферного розчину з рН 2,3 поміщають в мірну склянку місткістю 2000 мл, додають 900 мл ацетонітрилу. Після змішування доводять рН рухомої фази до значення 2,3 (потенціометр) кислотою ортофосфорной концентрованою.

Термін придатності рухомої фази 1 місяць.

Приготування буферного розчину з рН 2,3:

6,75 мл кислоти ортофосфорної концентрованої і 42,1 г натрію перхлорату поміщають в мірну колбу місткістю 2000 мл, додають 1600 мл води і доводять рН розчину до значення 2,3 (потенціометр) за допомогою розчину триетиламіну. Доводять об’єм розчину водою до мітки і перемішують.

Термін придатності розчину 1 місяць.

Перевірка придатності хроматографічної системи:

Хроматографічна система вважається придатною, якщо виконуються наступні умови:

- ефективність хроматографічної колонки, розрахована по піку стандартного гібридного білка на хроматограмах розчину порівняння, повинна бути не менше 2000 теоретичних тарілок;

- відносне стандартне відхилення, розраховане для площ піку стандартного гібридного білка на хроматограмах розчину порівняння і для піку зразка препарату гібридного білку на хроматограмах випробовуваного розчину повинне бути не більше 2,0 % кожного;

- коефіцієнт симетрії піку, розрахований по піку стандартного гібридного білка на хроматограмах розчину порівняння повинен бути не більше 1,8.

Розчин порівняння:

Наважку 2 мг стандартного рефолдованого гібридного білку поміщають в мірну колбу місткістю 20 мл, розчиняють в 2,0 мл 0,01 М розчину кислоти хлористоводневої. Об’єм доводять до мітки водою очищеною, перемішують.

По 0,02 мл досліджуваного розчину і розчину порівняння хроматографують на рідинному хроматографі Waters 600 з UV/VIS детектором Waters 486, одержуючи хроматограми для кожного з розчинів, в наступних умовах:

- колонка сталева розміром 4,6 мм×250 мм, заповнена сорбентом DAISOPAK SP–120–5–ODS–AP з розміром частинок 5мкм;

- рухома фаза А: буферний розчин – 2, рН 2,3 – ацетонітріл (9:1), дегазована будь–яким зручним способом;

- рухома фаза Б: буферний розчин – 2, рН 2,3 – ацетонітріл (2:3), дегазована будь–яким зручним способом;

- використовується наступна програма градієнту (табл. 9.3):

Таблиця 6.3

Умови проведення хроматографії

- швидкість рухомої фази – 1 мл/хв;

- детектування при довжині хвилі 214 нм;

- температура колонки 40 °С;

- час проведення хроматографії 60 хвилин;

- співвідношення фаз А і Б (46/54) підбирають так, щоб час утримування піку гібридного білка на хроматограмі складав 25–30 хвилин.

Вміст гібридного білка (Х) в перерахунку на гібридний білок в міліграмах в 1 мл проби розраховують за формулами:

Х = (S₁×m₀)/S₁, (6.2)

де, S₁ – значення площі піку гібридного білка, розраховане з хроматограми випробовуваного розчину; S₀ – значення площі піку стандартного гібридного білка, розраховане з хроматограми розчину порівняння; m₀ – маса наважки стандартного гібридного білка, в міліграмах.

Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту «Перевірка придатності хроматографічної системи».

Визначення оптичної щільності культури методом спектрофотометричного аналізу

Приготування зразка препарату: 1 мл розчину внести в мірну колбу місткістю 10 мл довести до мітки водою очищеною.

Одержаним зразком наповнюють кювету з товщиною шару 1 см. За допомогою спектрофотометра вимірюють оптичну густину зразка проти води очищеної при довжині хвилі 276 нм.

Концентрацію білка у зразку розрахувують за формулою:

С = А×0,961×Кр (г/л), (6.3)

де, С – концентрація білка, г/л; А – оптична густина зразка; 0,961 –поправочний коефіцієнт; Кр – коефіцієнт розведення зразка.

Вміст основної речовини в розчині розрахувують за формулою (9.4):

М = С×V, (6.4)

де, М – вміст основної речовини в розчині, г; С – концентрація білка у зразку, г/л; V – об’єм розчину, л.

6.3.3. Концентрація джерела вуглецю і азоту Визначення концентрації глюкози в культуральній рідині метод капілярного електрофорезу

Система капілярного електрофорезу серії «Капель» оснащена ультрафіолетовим детектором (254 нм) з наступними характеристиками: