растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) - аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.
Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.
Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение - Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli - для фасоли, Rhizobium lupini - для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.
Задачей производства бактериальных удобрения является максимальное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса, приготовление на их основе готовых форм препарата с сохранением активности в течение гарантийного срока хранения. Отечественная промышленность выпускает два вида нитрагина: почвенный и сухой. Впервые культура клубеньковых бактерий на почвенном субстрате была приготовлена в 1911 году на бактериально-агрономической станции в Москве. В настоящее время его производство имеет ограниченное значение, так как технология довольно сложна и трудоѐмка при выполнении отдельных операций. Более перспективна технология производства сухого нитрагина. Сухой нитрагин - порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5-7%. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать штаммы, устойчивые к высушиванию. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2% агара и 1% сахарозы, затем культуру размножают в
колбах на жидкой питательной среде в течение 1-2 суток при 28-30оС и рН 6.5-7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2-3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 7080%. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации ( в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75% клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2 - 1 кг, хранят при температуре 15оС не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом. Внесение нитрагина повышает урожайность в среднем на 15-25%.
Препарат клубеньковых бактерий может выпускаться и в виде ризоторфина. Впервые торфяной препарат клубеньковых бактерий был приготовлен в 30-х годах, но технология была создана в 1973-77 гг. Для приготовления ризоторфина торф сушат при температуре не выше 100оС и размалывают в порошок. Наиболее эффективным способом стерилизации является облучение его гамма-лучами. Перед стерилизацией размолотый, нейтрализованный мелом и увлажненный до 30-40% торф расфасовывают в полиэтиленовые пакеты. Затем его облучают и заражают клубеньковыми бактериями, используя шприц, с помощью которого впрыскивается питательная среда, содержащая клубеньковые бактерии. Прокол после внесения бактерий заклеивается липкой лентой. Каждый грамм ризоторфина должен содержать не менее 2.5 млрд. жизнеспособных клеток с высокой конкурентоспособностью и интенсивной азотфиксацией. Препарат хранят при температуре 5-6оС и влажности воздуха 40-55%. Пакеты могут быть весом от 0.2 до 1.0 кг. Доза препарата составляет 200 г на га. Заражение семян производят следующем образом: ризоторфин разбавляют водой и процеживают через двойной слой марли. Полученной суспензией обрабатывают семена. Семена высевают в день обработки или на следующий день.
Вопросы для самоконтроля
1.Назовите основные энтомопатогенные бактерии.
2.Какие группы токсичных продуктов энтомопатогенных бактерий вы знаете?
3.Перечислите энтомопатогенные препараты на основе микроскопических грибов.
4.Какие преимущества есть у Вирусных энтомопатогенных препаратов?
5.Какую функцию выполняют бактериальные удобрения?
6.Дайте характеристику основным бактериальным удобрениям, применяемым в нашей стране.
Тема 9 . Использование биотехнологии растений в сельском хозяйстве, селекции и растениеводстве
Главной задачей сельскохозяйственного производства является обеспечение населения страны в соответствии с медицинскими нормами качественными, биологически полноценными продуктами питания из сырья растительного и животного происхождения.
В геополитическом плане это обеспечение продовольственной независимости государства. Решение таких социально значимых задач объективно требует устойчивого экономического развития сельского хозяйства и всего агропромышленного комплекса страны, что напрямую связано с увеличением объемов производства сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия, с урожайностью сельскохозяйственных культур и продуктивностью сельскохозяйственных животных и птиц. Таких показателей можно добиться при условии технологической модернизации и внедрения в аграрное производство новейших научных достижений в селекционной деятельности и племенном животноводстве. Принятые за последние годы органами государственной власти меры экономикоправового характера оказывают свое позитивное воздействие на развитие отечественного сельского хозяйства. Вместе с тем остаются реальные проблемы, связанные с качественными показателями в растениеводстве и животноводстве.
Несмотря на внедрение в производство новейших селекционных достижений, по-прежнему сохраняется большой разрыв между биологической урожайностью сельскохозяйственных культур и так называемым амбарным весом, то есть тем, что фактически находится на хранении после подработки (сушки, сортировки и т. д.).
Современная биотехнология растений - сумма технологий, которые развиты по молекулярной и клеточной биологии растений, - новая стадия в развитии технологии селекции растений. С помощью этих технологий улучшение признаков может происходить на уровне индивидуального гена, а отдельные гены, определяющие определенный признак, могут быть идентифицированы. За ними может быть проведен отбор, их можно изолировать, ввести, удалить или модифицировать в генотипе растения или в сорте. Вклад биотехнологии в сельскохозяйственное производство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений, разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые против вредителей, болезней, гербицидов сорта сельскохозяйственных растений. Разработано технику оздоровления растений от накопления инфекций, что особенно важно для культур, которые размножаются вегетативно (картофель и др.). Одной из
актуальных проблем является возможность управлять процессом азотфиксации, в том числе возможность введения генов азотфиксации в геном полезных растений, а также управления процессами фотосинтеза. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков, разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты растений от вредителей и болезней, бактериальные удобрения. На современном этапе развития селекции для его интенсификации эффективное использование таких биотехнологических методов, как культура изолированных тканей, клеток и органов растений, клеточная селекция и генетическая инженерия, которые дают возможность за сравнительно короткие сроки создать и размножить ценный исходный высокопроизводительный материал, гетерозисных гибриды и сорта сельскохозяйственных растений.
Все проблемы, которые разрабатывают в культуре in vitro, можно разделить на три основные группы: n сохранения генетической информации клеток (микроклональное размножения растений и депонирования, культура зародышей, пыльников и семенных зачатков); n изменение генетической информации способом мутагенеза под влиянием физических и химических факторов (культура каллуса, клеточных суспензий, изолированных протопластов); n перенос и восстановление генетической информации (генно-инженерное конструирование растений с новыми признаками, соматическая гибридизация).
Одним из распространенных направлений метода культуры тканей является микроклональное размножения, при котором получают генетически идентичны формы, что способствует сохранению генетически однородного посадочного материала. Как эксплантатов можно использовать пазушные почки, молодые листья, некоторые элементы цветов и соцветий. Однако такой вид размножения требует конкретизации метода для каждой сельскохозяйственной культуры в связи с особенностями ее генотипа. Технология микроклонального размножения любой культуры объединяет четыре основных этапа: ввод исходной формы в стерильную культуру, собственно микроразмножения, укоренение размноженных побегов, перевод стерильной культуры в условиях открытого грунта. Разработка средств вегетативного размножения элитных растений, гетерозисных гибридов и сортов in vitro позволяет решить проблему быстрого размножения форм, имеющих практическую ценность, а также сохранения материала для использования в рекуррентные селекции.
Микроклональное размножения имеет определенные преимущества по сравнению с традиционными методами размножения: выращивание в искусственных условиях (контролируемых) тканей позволяет достичь извлечения вирусов и других патогенных микроорганизмов и получить здоровый посадочный материал; рост растений можно поддерживать в течение многих лет; методом культуры можно размножать формы, не размножающиеся вегетативно или не дающие жизнеспособных семян; можно выбирать генотипы, устойчивые к неблагоприятным условиям
выращивания: экстремальные температуры, засуха, засоление и закисление субстрата, угнетающее действие гербицидов и др., а также отбор продуктивных форм в условиях in vitro, скорость и коэффициент размножения достигает 1:1000000 и дает возможность вдвое-втрое сократить сроки отбора и получения новых растений в селекционных исследованиях.
На современном этапе существует несколько различных детально разработанных методов микроклонального размножения. Различаются они по состоянию исходных клеток и тканей, которые принимают для получения микроклонов. Важнейшим требованием технологии является гарантирование полной стерильности и оптимальных условий для клеточного деления и дифференциации исходной ткани. Затем следует добиться образования большого количества микроклонов и обеспечить их укоренения. Чтобы эффективность микроклонального размножения была высокой, нужно на всех этапах поддерживать оптимальные условия выращивания. Для этого для каждой культуры разрабатывают конкретную методику микроклонального размножения.
Укоренившиеся растения в случае необходимости размещают на депонирование пониженных температур. Это очень важный процесс, поскольку он позволяет задерживать развитие растений и таким образом длительное время сохранять их без пересадки, используя при необходимости. Для переноса стерильных растений в почву надо отбирать среди них здоровые, со светлой, хорошо развитой корневой системой. В репродуцированной культуре тканей видимых морфологических отклонений нет. Генетическая стабильность изолированной культуры наблюдается даже после многократных пассажей, что открывает новые возможности в сохранении генофонда сельскохозяйственных растений. Сохранение и дальнейшее размножение растений в культуре in vitro приобретает большое значение в связи с рекуррентным отбором. Из выращенных с помощью культуры in vitro маточных растений и корнеплодов получают высококачественные семена. В селекционной практике одновременно с микроклональное размножение растений широко используют метод каллусных культур из эксплантов различных органов, которые являются дополнительным резервом размножения селекционного материала. Он дает возможность практически использовать в селекционном процессе новый тип изменчивости – сомаклональную изменчивость. Каллусные культуры многих сельскохозяйственных растений характеризуются большой нестабильностью. Генетическая вариабельность соматических клеток является одной из причин неоднородности растений, полученных из каллусных тканей. Калусогенезу - это первый этап на пути получения сомаклональных вариантов требует перепрограммирования способов развития клетки. Клетка, переведенная в условия культивирования in vitro, сохраняет свою основную генетическую информацию о целом организм и при наличии соответствующих условий может реализовать ее. Однако физические и химические факторы культивирования, обладают мутагенным действием, а также генетическая гетерогенность соматических клеток