Наибольшее распространение среди промышленно выпускаемых микробных патогенов получили бактериальные препараты. Их отличительными особенностями являются высокая вирулентность по отношению к насекомым-вредителям, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителей и др. В настоящее время производятся препараты против более 160 видов насекомых.
Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные бактерии Bac.thuringiensis. Она не только разрушает насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует ряд токсичных продуктов. Среди этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:
α-экзотоксин, или фосфолипаза С, – продукт растущих клеток бактерий. Токсическое действие фермента связывают с индуцируемым им распадом незаменимых фосфолипидов в ткани насекомого, что приводит к гибели последнего.
β-экзотоксин – накапливается в культуральной жидкости при росте клеток. Считают, что молекула β-токсина состоит из нуклеотида, связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК-зависимой РНКполимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, β- экзотоксин - мутаген, поражающий генетический аппарат особей.
γ-экзотоксин – малоизученный компонент, неидентифицированный фермент (или группа ферментов).
δ-эндотоксин – параспоральный кристаллический эндотоксин. Образуется в процессе споруляции бактерии в противоположной от формирующейся споры части бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Доказано, что кристаллический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распадается на молекулы протоксина. Протоксин под действием протеиназ распадается на токсические фрагменты. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия δ-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия δ-токсина является средний отдел кишечника.
В зависимости от реакции на кристаллы насекомые делятся на три группы:
·характерен общий паралич;
·паралич среднего отдела кишечника;
·реакция на препарат в целом: гибель в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий.
Наиболее распространенные препараты на основе различных вариаций Bac. thuringiensis: энтобактерин, инсектин, алестин, экзотоксин, токсобактерин, дендробациллин, битоксибациллин.
Промышленное производство энтомопатогенных бактерий (ЭБ) заключается в глубинном культивировании. При этом ставится задача получения максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина. Требования к промышленным штаммам ЭБ: принадлежность штамма к определенному серотипу, высокая вирулентность и продуктивность на промышленных средах, устойчивость к комплексу фагов и т.д.
Технология производства включает все стадии, типичные для любого биотехнологического производства.
Составление питательной среды. Для культивирования Bac. thuringiensis
используют дрожже-полисахаридную среду, содержащую в процентах: кормовые дрожжи – 2 – 3; кукурузную муку – 1 – 1,5; кашалотовый жир – 1.
Подготовка посевного материала. Внесениение посевного материала.
Размножение культуры. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной (28 – 30 оС), продолжительность ферментации составляет 35 – 40 часов. Перед началом культивирования рН составляет около 6,3, к концу ферментации – повышается до 8,0 – 8,5, что может привести к разрушению кристаллов на более мелкие фрагменты и затруднить их выделение. Чтобы предотвратить это, культуральную жидкость перед переработкой подкисляют до 6,0 – 6,2. Культивирование заканчивают титре спор не менее 109 в 1 мл.
После сепарации культуральной жидкости получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг в 1 кубометре культуральной жидкости. Пасту перемешивают в течение получаса для однородного распределения спор и кристаллов и отбирают пробы на проверку титра, влажности, вирулентности, наличия фага.
Препарат предназначен для борьбы с садово-огородными вредителями, эффективен против 60 видов насекомых. Применяют путем опрыскивания растений водной эмульсией в период активного роста вредителя. Основная масса вредителей погибает в течение 2 – 10 дней. На 1 га расходуют: для овощных культур 1 – 3 кг, садовых – 3 – 5 кг.
Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических грибов вызывают у насекомых микозы.
Грибы обладают рядом особенностей:
·поражение происходит через кутикулу;
·насекомые поражаются в фазе развития куколки и имаго;
·большая скорость роста и огромная репродуктивная способность, в виде спор могут длительное время находится в природе без снижения энтомопатогенной активности;
· высокая специфичность, вирулентность сильно зависит от штамма гриба. Действие грибного препарата на насекомое начинается с
проникновения споры в полость тела через кожные покровы. Попав в тело, спора прорастает в гифу, затем разрастается мицелий, от которого отчленяются конидии. Оказавшись в теле, конидии циркулируют в гемолимфе. Уже на этой стадии возможно поражение насекомого вследствие выделения некоторыми штаммами значительного количества токсинов. В отсутствие токсина мицелий постепенно заполняет все тело насекомого, прежде всего поражается мышечная ткань. Рост гриба продолжается до тех пор, пока все ткани не будут разрушены. Могут образовываться конидиеносцы, прорывающие кутикулу и обволакивающие мертвую личинку.
В промышленном производстве используются отдельные штаммы в основном трех родов: Beaveria, Metarrhizium, Entomophtora.
Технология получения препарата энтомопатогенных грибов боверина
методом глубинного культивирования включает обычные стадии. Составление питательной среды. Питательная среда содержит в процентах: дрожжи кормовые – 2; крахмал – 1; хлорид натрия – 0,2; хлорид марганца – 0,01; хлорид кальция – 0,05. Последний компонент обеспечивает устойчивость конидий к неблагоприятным факторам, поэтому его содержание может сильно варьировать (до 5 %).
Подготовка посевного материала. Внесениение посевного материала.
Размножение культуры ведут при рН 4,5 – 5,6, температуре 25 – 28 оС в течение 3 – 4 суток в условиях постоянного перемешивания и аэрации. В среде необходимо также наличие аминного азота, так как его недостаток снижает скорость роста культуры и процент образования конидиоспор, избыток ведет к образованию гонидий.
Культуральную жидкость подвергают сепарации и фильтрованию, после чего пасту сушат на распылительной сушке.
Готовый препарат – порошок кремового или белого цвета, содержащий в 1 г от 1,5 до 6 млрд. конидиоспор. Препарат безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывет ожогов у растений.
Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наибольшей специфичностью по отношению к насекомому-хозяину. Они поражают не более одного вида. Их ярко выраженная специфичность обуславливает практическую безвредность вирусных препаратов для человека, флоры и фауны.
Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, они способны сохранять активность в течение 10 – 15 лет, находясь вне насекомого. Заражение вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелочных значениях рН разрушаются. Освобожденные вирионы проникают через стенку кишечника в клетки, где в ядрах происходит репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к
гибели насекомого. Отличительной особенностью вирусов является то, что они могут размножаться только в живой ткани. Это создает определенные трудности в организации промышленного производства, так как технология размножения вирусов должна быть связана с использованием живых насекомых-хозяев.
В нашей стране осуществляется выпуск трех вирусных энтомопатогенных препаратов: вирин-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ (против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой бабочки).
Разведение насекомых. Производство любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние.
Получение инокулята. Инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок.
Заражение насекомых. На определенной стадии развития (обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. Экспозиция насекомых. После заражения насекомых выдерживают в строго определенных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в тканях.
Отбор мертвых и отмирающих личинок. Через 7 – 9 суток собирают мертвые и отмирающие личинки, подсушивают при температуре 33 – 35 оС, измельчают механическим способом для вывода телец-включений из тканей.
Выделение вирусных компонентов. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь полученных тканей фильтруют.
При производстве вирин-ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют простерилизованный глицерин. Готовый препарат разливают во флаконы.
При производстве вирин-ЭНШ в фильтрат добавляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотношении 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, осадок подсушивают до полного удаления ацетона. Если препарат планируется выпускать в виде порошка, то сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем (каолином, например) до получения титра полиэдров 1 млрд. полиэдров в 1 грамме.
Масляную форму препарата получают путем диспергирования осадка в стерильном 50 % растворе глицерина до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, а затем добавляют равный объем солярового масла, перемешивают и разливают по флаконам.
Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем внесения полиэдров в плотные популяции насекомых-вредителей с целью возникновения в них эпизоотий. Данный способ обработки предполагает внесение небольших количеств препарата. В другом случае опрыскивание
или опыление производят на зараженных участках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития.
Бактериальные удобрения — это препараты, способствующие улучшению питания растений. Питательных веществ они не содержат. Препараты, в которых содержатся полезные для сельскохозяйственных растений почвенные микроорганизмы. При внесении этих удобрений в почве усиливаются биохимические процессы и улучшается корневое питание растений.
Самыми распространенными бактериальными удобрениями являются:
нитрагин — препарат, содержащий клубеньковые бактерии, которые поставляют к растениям азот. Используется только для бобовых растений, причем для каждого вида культуры разный тип бактерий;
азотобактерин — препарат, содержащий азотобактерии, которые также поставляют азот. Однако эти существа универсальны и могут применяться на разных культурах;
фосфобактерин — препарат, содержащий фосфобактерии, соответственно, переносят к корням растений фосфор;
ЭМ-препарат (эффективные микроорганизмы) — содержит несколько видов микроорганизмов, которые вместе комплексно воздействуют на растения.
Все бактериальные удобрения вносятся в почву в очень малых количествах (несколько капель на 1 л дождевой воды).
Вносить такие удобрения следует, соблюдая ряд правил:
почва должна быть влажной;
раствор не должен попадать на побеги растений;
микроорганизмы не любят много света, поэтому препараты лучше вносить поздно вечером или в пасмурную погоду;
ослабленные по различным причинам растения (от вредителей, болезней) либо посаженные недавно не стоит удобрять таким образом, потому что они слишком слабы.
Так как бактериальные удобрения содержат живых существ, то хранение их должно быть особым: от заморозки и слишком высокой температуры бактерии погибнут. Данный вид удобрений не выдерживают длительного хранения, поэтому готовят их в количестве, необходимом лишь для одного сезона. Хранят в заводской таре в сухом помещении при температуре от 0 до 10 °C; нельзя хранить на складе, где находятся летучие ядохимикаты.
Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне