Введение в суспензионную культуру клеток Artemisia vulgaris L
Е.Е. Антонова, Е.В. Кучарова, Ж.М. Охлопкова
Аннотация
Актуальность и цель. Растения рода Полынь (Artemisia L.) представляют интерес как источники вторичных метаболитов, востребованных для разработки профилактических и лечебных средств. Технологии и методы культивирования клеток растений in vitro считаются альтернативным путем получения растительного лекарственного сырья. Целью работы является введение в суспензионную культуру клеток in vitro Artemisia vulgaris L. на основе каллусной культуры клеток, полученной от дикорастущего растения центрально-якутской популяции. Материалы и методы. Наземная фитомасса полыни обыкновенной была собрана на территории фитоценозов Хангаласского и Намского районов Руспублики Саха (Якутия) в 2020-2021 гг. Для получения каллусных культур клеток в качестве инициальных эксплантов были использованы листья стерильных растений, выращенных в контролируемых условиях из семян дикорастущих растений. Экспланты культивировали на питательной среде Мурасиге - Скуга (МС) с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, ки- нетина, 6-бензиламинопурина и а-нафтилуксусной кислоты. Из первичных каллусов была выделена линия для дальнейшего сохранения путем пересадки на новые питательные среды. Далее каллусы из этой линии были использованы для получения суспензионной культуры клеток Artemisia vulgaris L. с пересадкой в жидкую среду МС. Результаты. Максимальный рост биомассы суспензии Artemisia vulgaris L. наблюдался в среде МС с добавлением 6-бензиламинопурина (0,2 мг/л) и а-нафтилуксусной кислоты (0,5 мг/л) на варианте каллуса, полученной при сочетании 2,0 мг/л 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,5 мг/л а-нафтилуксусной кислоты в твердой питательной среде МС. Полученная суспензионная культура клеток полыни обыкновенной представлена паренхимоподобными агрегатами из двух морфологических групп клеток округлой формы и клеток вытянутой и/или червеобразно-удлиненной формы. Выводы. Определен оптимальный гормональный состав для введения в суспензионную культуру клеток Artemisia vulgaris L. на основе каллусной культуры листового происхождения. Сочетание гормонов НУК и 6-БАП в жидкой среде МС позволило получить клеточную биомассу с наилучшим показателем индекса роста. Полученные данные будут использованы для изучения дыхательной активности суспензионной культуры клеток полыни обыкновенной и для подбора оптимальных условий аппаратного выращивания в условиях биореактора.
Ключевые слова: культура клеток in vitro, суспензионная культура клеток, Artemisia vulgaris L.
Abstract
Introduction to the suspension Artemisia vulgaris L. cell culture E.E. Antonova, E.V. Kucharova, Zh.M. Okhlopkova
Background. Plants of the genus Artemisia L. are of interest as sources of secondary metabolites in demand for the development of preventive and therapeutic agents. Technologies and methods of cultivation of plant cells in vitro are considered an alternative way of obtaining herbal medicinal raw materials. The aim of the work is to introduce Artemisia vulgaris L. into the suspension culture of cells in vitro based on a callus cell culture obtained from a wild plant of the Central Yakut population. Materials and methods. The ground phytomass of common wormwood was collected on the territory of the phytocenoses of the Khangalassky and Namsky districts of the Republic of Sakha (Y akutia) in 20202021. To obtain callus cell cultures, leaves of sterile plants grown under controlled conditions from seeds of wild plants were used as initial explants. Explants were cultured on Mu- rashige-Skoog nutrient medium (MS) with the addition of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, kinetin, 6-benzylaminopurine and a-naphthylacetic acid. A line was isolated from the primary callus for further preservation by transplanting to new nutrient media. Further, calluses from this line were used to obtain a suspension culture of Artemisia vulgaris L. cells with transplantation into a liquid medium MS. Results. The maximum growth of the cell biomass of Artemisia vulgaris L. suspension was observed in the medium MS with the addition of 6-benzylaminopurine (0.2 mg/L) and a-naphthylacetic acid (0.5 mg/L) on the callus variant obtained by combining 2.0 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 0.5 mg/L a- naphthylacetic acid in a solid medium MS. The resulting suspension culture of wormwood cells is represented by parenchyma-like aggregates of two morphological groups of cells of rounded shape and cells of elongated and/or worm-like elongated shape. Conclusions. The optimal hormonal composition for the introduction of Artemisia vulgaris L. cells into suspension culture has been determined based on callus culture of leaf origin. The combination of the hormones NAA and BAP in a liquid medium MS allowed to obtain cellular biomass with the best growth index. The obtained data will be used to study the respiratory activity of a suspension culture of Artemisia vulgaris L. cells and to select optimal conditions for hardware cultivation in a bioreactor.
Keywords: cell culture in vitro, suspension cell culture, Artemisia vulgaris L.
Введение
Клеточные технологии высших растений дают возможность получения альтернативного растительного лекарственного сырья в виде каллусных и суспензионных клеток in vitro, аккумулирующих вторичные метаболиты, которые могут храниться длительное время в лиофильно высушенном состоянии без потери фитохимического состава и физиологической активности [1].
Перспективными объектами в этом направлении являются представители рода Artemisia L. Одним из широко распространенных в природе и применяемых в народной медицине видов этого рода является Artemisia vulgaris L.
Полынь обыкновенная, чернобыльник, по-якутски «уерэ ото» - многолетнее травянистое растение семейства Сложноцветные (Asteraceae), один из 22 видов рода Artemisia L., произрастающих на территории Центральной Якутии [2, 3]. Цветение центрально-якутских популяций наблюдается в июле- августе. Произрастает на пустырях, огородах, сорных местах, окрестностях домов, реже - на лугах и берегах рек. На территории Якутии полынь обыкновенная распространена повсеместно, большое количество популяций отмечено в Центральной, Южной и Северо-Восточной Якутии [4].
Полынь обыкновенная (A. vulgaris) является богатым источником таких вторичных метаболитов, как монотерпеновые, сесквитерпеновые и флавоно- идные соединения, трава полыни имеет многовековой опыт применения в народной медицине как слабительное, потогонное, мочегонное, глистогонное средство и проявляет антиоксидантную, антибактериальную и противовирусную активность [5]. Исследования также показали наличие у полыни обыкновенной противовоспалительных, гиполипидемических, антималярийных, противоопухолевых, бронхорасширяющих и противосудорожных свойств [6-9]. В последние годы был показан высокий потенциал представителей рода Artemisia против коронавирусной инфекции [10-12].
Целью работы является получение суспензионной культуры A. vulgaris in vitro на основе каллусных культур, инициированных от листовых эксплан- тов стерильных проростков, выращенных на основе семян дикорастущего растения центрально-якутской популяции.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) оптимизация питательной среды для инициации суспензионной культуры клеток A. vulgaris in vitro;
2) получение первичной суспензионной культуры клеток A. vulgaris и морфологический анализ клеток;
3) анализ интенсивности перехода каллусной культуры A. vulgaris в суспензионную культуру in vitro;
4) анализ динамики роста суспензионной культуры клеток A. vulgaris in vitro.
Материалы и методы
суспензионный культура клетка питательный
Надземная фитомасса полыни обыкновенной была собрана во время экспедиционных работ на территории фитоценозов Хангаласского и Намско- го районов Республики Саха (Якутия) в 2020-2021 гг.
Растительный материал подвергали естественной сушке, равномерно выстелив в сухом хорошо проветриваемом помещении. Полностью высушенную фитомассу клали на специальный подготовленный сухой поддон, где проводили камеральную обработку и вылущивание семян. Семена помещали в крафтовые или пергаментные пакетики, указывали дату и место сбора и хранили в условиях холодильника. Семена полыни обыкновенной центрально-якутской популяции, как и семена других дикорастущих растений Якутии, входят в коллекцию лаборатории «Молекулярно-генетические и клеточные технологии» (УНЛ «МГиКТ») СВФУ.
Во время проведения клеточно-культуральных работ придерживались требований и подходов, применяемых для работы с культурами клеток высших растений [13]. Каллусы были инициированы и получены от листовых эксплантов стерильных проростков, выращенных из семян A. vulgaris центрально-якутской популяции [14].
Для получения суспензионной культуры A. vulgaris была использована линия каллусных культур полыни обыкновенной, выведенная от 18 марта 2019 г. в условиях УНЛ «МГиКТ».
В качестве питательной среды была использована стандартная питательная среда Мурасиге - Скуга (МС) без агара [15, 16]. Приготовленная питательная среда проходила обработку в паровом стерилизаторе (автоклаве) ВК-75-01 (АО «ТЗМОИ», Россия) при температуре 120 °С в течение 2 ч. Сначала в среду с помощью дозатора добавляли определенное сочетание синтетических гормонов: 2,4-дихлорфеноксиускусную кислоту (2,4-Д), а-нафтил- уксусную кислоту (НУК), кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП) в различной дозировке, разливали по 100 мл среды в колбы на 250 мл. Затем в асептических условиях с помощью пинцета в каждую колбу с питательной средой помещали кусочек каллуса, после чего закупоренные колбы ставили в орбитальный шейкер PSU-20i (Biosan, Латвия) с постоянным перемешиванием на скорости 120 об/мин.
Для пересадки суспензионных культур клеток использовали стеклянные пипетки на 10 мл и силиконовые трубки, обработанные в сухожаровом шкафу при температуре 120 °С в течение 2 ч. В пипетки в качестве фильтра на одном из концов была набита вата. С помощью стерильных пипеток с трубками из полученной первичной суспензионной культуры клеток отбирали 20 мл суспензии на 100 мл новой порции питательной среды в колбах на 250 мл.
Нами были использованы питательные среды, которые помимо базовых солей содержали различные соотношения фитогормонов: первый вариант (№ 1) включал в себя фитогормоны НУК (0,5 мг/л) и кинетин (0,5 мг/л); второй вариант (№ 2) - 2,4-Д (0,5 мг/л) и НУК (0,5 мг/л); третий вариант (№ 3) - 6-БАП (0,2 мг/л) и НУК (0,5 мг/л); четвертый вариант (№ 4) - кинетин (0,5 мг/л), НУК (0,5 мг/л) и 6-БАП (0,2 мг/л).
Общую характеристику роста биомассы суспензионной культуры in vitro анализировали с помощью общепринятого показателя - ростового индекса [13, 17]. Индекс роста (I) вычисляется на основе следующей формулы:
где X max - максимальное содержание клеточной биомассы, г; X 0 - начальное содержание клеточной биомассы, г.
Для каждого измерения по датам использовали три повторности (по три пробы из колбы, n = 3). Взвешивание отобранных образцов суспензионной культуры клеток проводили с помощью высокоточных аналитических весов Adventurer™ Pro (Ohaus, США) дискретностью 0,0001 г.
Морфологическую характеристику суспензионных культур клеток A. vulgaris определяли визуально. Для более подробного описания дифференциации, пролиферации и особенностей морфогенеза был проведен цитологический анализ на временных давленых микропрепаратах, которые были предварительно окрашены свежеприготовленным 0,1 % раствором метиленового синего. Наблюдение проводилось с помощью микроскопа Primo Star (ZEISS,
Германия) со встроенной камерой AxioCamErc 5 s при увеличениях х40, х100 и х400.
Результаты и обсуждение
Наиболее интенсивный переход в суспензионную культуру клеток in vitro мы наблюдали при варианте культивирования № 2 с сочетанием 2,4-Д (0,5 мг/л) и НУК (0,5 мг/л) в питательной среде МС. Для сохранения полученного штамма суспензионной культуры клеток A. vulgaris пассаж проводили с интервалом каждые 21 сут в другой культуральный сосуд с питательной средой МС с тем же составом фитогормонов.
Полученная суспензионная культура A. vulgaris L. обладала следующими морфологическими характеристиками: биомасса преимущественно однородная, слегка плотноватая, обводненная, имеет бледную зеленоватобежевую окраску. Цитологический анализ показал, что суспензионная культура состоит из паренхимоподобных агрегатов из двух морфологических групп клеток, преимущественно из паренхимных клеток округлой формы и в малом количестве - из клеток вытянутой и/или червеобразно удлиненной формы (рис. 1). На основе полученного штамма суспензионной культуры клеток мы проводили исследование для оптимизации питательных сред для суспензионных культур полыни обыкновенной.
Рис. 1 Морфологическая структура клеток в суспензионной культуре Artemisia vulgaris L. (метиленовый синий, увеличение х100)
Далее питательную среду модифицировали различными сочетаниями фитогормонов: 2,4-Д, 6-БАП, НУК и кинетина. По возможности образования суспензионных биомасс и по индексу роста в расчете на сырую массу суспензий мы выделили те сочетания фитогормонов, которые демонстрировали наиболее высокий результат.
Анализ динамики роста суспензионных культур клеток A. vulgaris показал, что прирост по сырой массе при варианте культивирования № 1 в течение 18 сут составил 8,14 г, по сухой массе - 0,38 г; при варианте № 2 прирост по сырой массе в течение 18 сут составил 7,25 г, по сухой массе - 0,41 г; при варианте № 3 прирост по сырой массе в течение 20 сут составил 38,99 г, прирост по сухой массе - 1,36 г. При варианте культивирования № 4 прирост по сырой массе в течение 18 сут составил 8,75 г, по сухой массе - 0,41 г. Из апробированных вариантов культивирования наилучший рост суспензионной культуры клеток in vitro для полыни обыкновенной наблюдается при варианте № 3 с сочетанием фитогормонов 6-БАП (0,2 мг/л) и НУК (0,5 мг/л). Варианты культивирования № 1, № 2 и № 4 показывают схожие между собой результаты и значительно уступают по показателям роста (рис. 2, 3).
Рис. 2 Динамика роста суспензионной культуры клеток Artemisia vulgaris L. по сырой массе при разных вариантах культивирования