Статья: Внеклеточные компоненты биопленок в формировании антибиотикорезистентности и хронизации воспалительного процесса. Состояние проблемы

Статья по теме:

Внеклеточные компоненты биопленок в формировании антибиотикорезистентности и хронизации воспалительного процесса. Состояние проблемы

Д.И. Заболотный, М.Б. Самбур, Н.В. Ворошилова, С.В. Веревка, ГУ «Институт отоларингологии им. проф. А.И. Коломийченко НАМН Украины» (дир. - акад. НАМН Украины, проф. Д.И. Заболотный)

Антибиотикорезистентность - причины и проблемы

В ряду многочисленных медикосоциальных проблем современности особое место занимает возрастание антибиотикорезистентности патогенных микроорганизмов. Согласно определению ВОЗ, резистентность в отношение антимикробных препаратов является проявлением стойкости микроорганизмов к препарату, бывшему ранее эффективным средством лечения обусловленных этим микроорганизмами заболеваний [12]. Это явление обрело всемирное распространение, причем в последние десятилетия со всей остротой поднялась проблема полирезистентности - стойкости микробиологических возбудителей в отношении разных типов антибиотиков [13]. Появление и стремительное распространение подобного рода патогенов не только существенно осложняет лечение соответствующих заболеваний, но и создает предпосылки для регресса клинической медицины с возвращением в доантибиотиковую эру [33].

На сегодняшний день известно свыше 6000 антибиотиков, однако лишь 2-3% из них применяются в клинической практике. Остальные оказались либо недопустимо токсичными, либо недостаточно эффективными. При этом за последние десятилетия не было создано ни одного нового антибиотика, а так называемые “новые” являются лишь измененными лекарственными формами, отличающимися главным образом все возрастающими дозами препарата [8]. Ведущие фамацевтические компании просто не заинтересованы в производстве новых антибиотиков, поскольку формирование резистентных к ним форм возбудителей происходит очень быстро - приблизительно в течение 1 года. Это исключает получение фирмой-производителем надлежащей прибыли на средства, вложенные в разработку и продвижение на рынок нового препарата. В то же время постоянное возрастание резистентности возбудителей заболеваний к антимикробным препаратам ежегодно приводит к миллионам смертельных случаев. В этом отношении показателен пример отмеченной в Европе в 2011 г. вспышки кишечной инфекции, обусловленной кишечной палочкой штамма E. coli O104:H4, или ЕНЕС. В отношении этого возбудителя известные антибиотики оказались практически неэффективными [4]. Это инициировало принятие комплекса рекомендаций, сводящихся к предоставлению большей части пациентов возможности выздороветь самим по себе, к какой-то части - предоставлению симптоматического лечения и лишь в самых тяжелых случаях признается целесообразным применение двух типов антибиотиков, которые, как предполагается, не усиливают выброс токсинов и не приводят к летальному исходу [8]. Очевидная неэффективность подобных рекомендаций исчерпывающе объясняет интерес к механизмам формирования антибиотикорезистентности и путям их преодоления.

Чем же обусловлено развитие антибиотикорезистентности? Явление это не является чем-то качественно новым, с чем разнообразные микроорганизмы ранее не встречались. Антибиотики являются средствами, обретенными самими микроогранизмами на протяжении своей эволюции. Не менее рутинным является и формирование сопротивляемости их действию. То есть наблюдается непрерывное соревнование между усовершенствованием повреждающего действия одних микроорганизмов и выработкой защитных механизмов другими [4]. Одним из полей этого соревнования стала человеческая популяция, в которой применение антибиотиков на современном этапе происходит в абсолютно неестественных сверхвысоких количествах.

Единого мнения о причинах формирования антибиотикорезистентности инфекционных патогенов не существует, однако ведущими единогласно признаются три причины [4, 8, 24]:

широкое применение антибиотиков и структурно подобных им веществ в ветеринарии, что приводит к их постоянному поступлению в человеческий организм с пищей в низких субтерапевтических дозах;

неконтролируемое самолечение антибиотиками, обычно прекращаемое при исчезновении внешних признаков заболевания и, как следствие, способствующее формированию и распространению резистентных штамммов возбудителя;

формирование полирезистентных штаммов в лечебных учреждениях, поскольку именно там бактерии подвергаются наиболее интенсивному влиянию разнообразных антибиотиков. Подобные штаммы получили название “госпитальных суперинфекций”, в разных формах присутствующих во всех без исключения клиниках.

К приведенному списку стоит добавить присутствие в стационарах неизвестных штаммов, нерациональные схемы применения антибиотиков, использование просроченных препаратов и многое другое [14]. Тот факт, что не учитываются особенности возбудителя у каждого конкретного больного, также способствует формированию и распространению антибиотикорезистентных штаммов. В последнем случае, при отсутствии данных лабораторных исследований, назначение антибиотика широкого спектра действия может временно погасить внешние признаки заболевания, однако будет способствовать развитию антибиотикорезистентности, а также целого ряда сопутствующих осложнений. Своевременное же выявление характера антибиотикорезистентности инфицирующего агента данного конкретного пациента может быть основанием для применения так называемых антибиотиков резерва - редко употребляемых, а потому дорогих, использующихся в крайнем случае [8].

Биопленки и резистентность

В отношении причин возникновения резистентности к антибиотикам также единого мнения не существует [4]. Полагают, что она может развиться у определенной части бактерий данного вида вследствие природной резистентности. Обычно природные инфекционные агенты представляют собой пул разных штаммов одного патогенного организма. При воздействии антибиотика более устойчивые штаммы становятся доминирующими. Немаловажная роль отводится и генетическим мутациям, приводящим к образованию антибиотикорезистентной формы. Здесь ведущую роль играют разнообразные варианты горизонтального переноса генов между микроорганизмами как одного, так и разных видов, что в условиях селекции, обусловленной прессингом антибиотика, обеспечивает доминирование резистентных штаммов [4, 8, 23, 29].

Принято считать, что основные механизмы антибиотикорезистентности опосредованы процессами, включающими нейтрализацию действия антибиотика посредством его модификации (гидролиз, фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование), активное удаление антибиотика из клетки (эффлюкс), изменение свойств мишени воздействия антибиотика и изменение проницаемости внешней мембраны [4]. При этом, однако, не учитывается такая важная черта абсолютного большинства микроорганизмов, как их существование в форме биопленок.

Согласно общепринятому определению, биопленка - это агрегат микроорганизмов, в котором клетки зафиксированы между собой и/или с нерастворимой поверхностью посредством встраивания в матрицу из внеклеточного полимерного вещества (ВПВ), синтезируемого самими клетками [39]. Биопленки существуют как в фиксированном на поверхности раздела фаз состоянии, так и в мобильной, не связанной с каким-либо субстратом форме. Природные биопленки, как правило, многокомпонентны и сформированы несколькими - иногда сотнями - видов микроорганизмов разных физиологических групп [9]. Отдельные члены подобного сообщества состоят между собой в сложных симбиотических взаимодействиях, обеспечивая тем самым повышение сопротивляемости подобного сообщества и его выживание [34].

Концепция биопленок предложена сравнительно недавно - в середине 80-х годов прошлого века [9]. За прошедшие годы проведены многосторонние исследования самих разнообразных биопленок как основной формы жизни. По интенсивности разрастания микроорганизмы в составе биопленок значительно уступают свободным планктонным формам, однако именно биопленки являются основной формой существования микроорганизмов. Обусловлено это повышенной сопротивляемостью биопленок воздействию разнообразных неблагоприятных факторов окружающей среды, включая антибиотики. Подробно описаны стадии формирования биопленок, дифференциация фенотипа клеток в их составе, механизмы формирования каналов питания, горизонтального переноса генов, формирования отличных между собой по фенотипу форм и многое другое. При этом, несмотря на интенсивные исследования, единого мнения о причинах высокой сопротивляемости биопленок воздействию неблагоприятных факторов нет [9]. Не упуская из виду генетические преобразования, претерпеваемые микроорганизмами в составе сложных многокомпонентных социумов, обратим внимание на структуру внеклеточного полимерного вещества (ВПВ) [22], в состав которого входят углеводы, белки, липиды и нуклеиновые кислоты (рис. 1).

Рис. 1 - Флуоресценция составляющих компонентов биопленок. Нуклеиновые кислоты окрашены SybrGreen и светятся зеленым, лектиновые включения окрашены ААЬ-А1еха568 и светятся красным, аутофлуоресценция хлорофилла 11А - синяя, аутофлуоресценция цианобактерий - фиолетово-белая. Размер кадра 246х246 мкм [26]

Как видно из представленной информации, ВПВ является не аморфным многокомпонентным гелем, а достаточно структурированным образованием. Составляющие ВПВ не только в той или иной степени задействованы в формировании и обеспечении жизнедеятельности трехмерного ассоциата микроорганизмов, но и в его воздействии на организм хозяина. Углеводы обеспечивают надлежащий уровень гидратированности биопленки, ее проницаемость для необходимых клеткам веществ. Нерастворимые компоненты ВПВ обеспечивают адгезивные связи как между отдельными микроогранизмами в составе биопленки, так и самой биопленки в отношении нерастворимых поверхностей. Они же ковалентно конъюгируют секретируемые бактериями и высвобождающиеся при их распаде ферменты, формируя тем самым своего рода внешнюю пищеварительную систему, переводящую поступающие из окружающей среды вещества и остатки отмерших микроорганизмов в приемлемую для клеток биопленки питательную форму [21, 22]. Образованные из секретированных микроорганизмами белков Р-структурированные фибриллы являются своего рода строительными лесами трехмерной структуры биопленки [37].

В контексте нашей работы особого внимания заслуживает рассмотрение причин высокой резистентности биопленок к воздействию антибиотиков. В этом отношении биопленки качественно - на 2-3 порядка - превосходят одноклеточные планктонные формы [9]. Показано, что ВПВ способны сорбировать и накапливать разнообразные токсины, включая антибиотики [21, 28]. Подобное свойство равноценно созданию фильтрационного барьера, резко уменьшающего количество токсических молекул,способных достичь внутриклеточного пространства. Особого внимания при этом заслуживает роль внеклеточной ДНК (eDNA). Изначально полагали, что внеклеточная ДНК является одним из видов останков отмерших и разрушенных клеток, источником фосфора и энергии для выживших клеток.

Таблица 1 - Способ действия и механизмы резистентности основных антибиотиков [4]

Впоследствии установлено ее участие в адгезивных взаимодействиях на ранних стадиях формирования биопленки [38, 41]. Внеклеточная eDNA способна эффективно связывать отдельные виды токсинов и антибиотиков [18, 25]. Последнее обстоятельство заставляет вспомнить, что основная часть антибиотиков проявляет свое бактерицидное действие за счет способности влиять на процессы транскрипции и трансляции, то есть вследствие того или иного взаимодействия с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами (табл.).

Развернутые нити дехроматизирован- ной ДНК в составе ВПВ могут существенно снижать возможности молекул антибиотика попасть во внутриклеточное пространство и, тем самым, воздействовать на опосредованные внутриклеточными нуклеиновыми кислотами процессы. Связывание же внеклеточной ДНК молекул антибиотика никоим образом не влияет на функционирование клетки. Подобного рода защита по самой природе своей широко специфична, поскольку снижает эффективность любых антибиотиков, нацеленных на взаимодействие с нуклеиновыми кислотами. В то же время не лишне отметить способность ВПВ сорбировать токсические вещества самой разнообразной природы [21]. Тем самым внеклеточное полимерное вещество оказывается своего рода фильтром, защищающим клетку от воздействия нежелательных веществ.

Частичное отмирание как условие выживания сообщества?

Из изложенного материала логично проистекает ряд следствий, хорошо согласующихся с известными данными о не исключающих друг друга свойствах самих разнообразных биопленок. Присущий микроорганизмам интенсивный обмен веществ приводит к постоянному обновлению компонентов внеклеточного полимерного вещества - как их распада, так и синтеза. Для последнего требуется значительные количества строительного материала - секрети- руемого живыми клетками либо исходящего от отмерших. Первый источник достаточно ограничен, емкость же второго более чем достаточна. Поэтому формирование, поддержание и развитие биопленок требует постоянного образования обреченных на отмирание, нежизнеспособных в данных условиях клеток. Подобное предположение хорошо согласуется со стимуляцией образования биопленок токсинами [25]. В составе биопленок присутствуют отличные между собой по фенотипу формы одних и тех же микроорганизмов, не отличающихся между собой по генотипу. Причины подобного рода фенотипической пластичности остаются дискуссионными. Наиболее вероятным объяснением считается горизонтальный перенос генов - признанный фактор микробной эволюции [9, 21]. При этом подавляющее большинство новообразуемых мутантных форм оказываются нежизнеспособными, подлежащими распаду, и лишь незначительная часть обретает полезные мутации, формируя тем самым клеточную составляющую резистентной к конкретному неблагоприятному фактору биопленки. Тем самым воздействие любого неблагоприятного фактора стимулирует дисперсию фенотипа, а массовое образование нежизнеспособных форм обеспечивает количественные и качественные изменения ВПВ, обеспечивая тем самым выживание сообщества микроорганизмов в целом. Так, токсическое действие ионов тяжелых металлов приводит к формированию антибиотикорезистентности [36]. По всей вероятности, массовое отмирание составляющих биопленку микроогранизмов приведит к качественному изменению состава ВПВ, что и обеспечивает развитие антибиотикорезистентности у выжившей части сообщества микроорганизмов.