Статья: Влияние тетрапептида leu-ile-lys-met на функцию почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе

Статья по теме:

Влияние тетрапептида leu-ile-lys-met на функцию почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе

Жариков Александр Юрьевич, доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой фармакологии, ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России

Якушев Николай Николаевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармакологии, ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России

Мазко Олеся Николаевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакологии, ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России

Макарова Олеся Геннадьевна, кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакологии, ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России

Цель исследования - изучить влияние тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met на функцию почек и образование почечных конкрементов у крыс при экспериментальном 6-недельном оксалатном нефролитиазе. Эксперименты проведены на 20 аутбредных крысах-самцах сток Вистар возрастом 2-3 месяца и массой от 250-300 г, разделенных поровну на две группы - сравнения (6 недель моделирования нефролитиаза) и подопытную (6 недель моделирования нефролитиаза + ежедневное внутрижелудочное введение тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met в дозе 12 мг/кг в период с 4 по 6 неделю). Оксалатный нефролитиаз моделировали при помощи общепринятой эти-ленгликолевой модели. До начала моделирования нефролитиаза, а затем каждые 7 дней в моче определяли биохимические параметры функции почек: величина диуреза, уровень экскреции креатинина и активность маркерных ферментов повреждения нефротелия - лактатдегидрогеназы и у-глутамилтрансферазы. По истечении 6 недель эксперимента крыс подвергли эвтаназии под эфирным наркозом и извлекли почки для морфологической оценки степени интенсивности процессов камнеобразования. Установлено, что уровень диуреза в обеих группах на протяжении эксперимента оставался стабильным и между группами не различался. Экскреция креатинина в группе сравнения к концу опыта снижалась в 2 раза (p = 0,017), а в подопытной группе оставалась стабильной. К концу лечения активность лактатдегидрогеназы и у-глутамилтрансферазы в подопытной группе существенно уступала уровню группы сравнения. Доказано, что трехнедельное применение тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met при экспериментальном оксалатном нефролитиазе нормализует функцию почек и ослабляет повреждение нефроцитов, что сопровождается отсутствием признаков камнеобразования в почках.

Ключевые слова: тетрапептид Leu-Ile-Lys-Met, оксалатный нефролитиаз, функция почек.

INFLUENCE OF Leu-Ile-Lys-Met TETRAPEPTIDE ON THE KIDNEY FUNCTION AT EXPERIMENTAL OXALATE NEPHROLITHIASIS

ZharikovAleksandr Yu., Dr. Sci (Bio.), Associate Professor, Head of Department, Altai State Medical University

Yakushev Nikolay N.,Сand. Sci. (Med.), Associate Professor of Department, Altai State Medical University

MazkoOlesya N.,Сand. Sci. (Bio.), Associate Professor of Department, Altai State Medical University, 40 Lenin avenue, Barnaul

Makarova Olesya G.,Сand. Sci. (Pharm.), Associate Professor of Department, Altai State Medical University

The study aimed to analyse the effect of the Leu-Ile-Lys-Met tetrapeptide on the function of the kidneys and the formation of renal calculi in rats with experimental 6-week oxalate nephrolithiasis. The experiments were conducted on 20 outbred male Wistar rats 2-3 months old and weighing 250-300 grams, divided equally into 2 groups - comparison (6 weeks of nephrolithiasis modeling) and experimental (6 weeks of nephrolithiasis simulation + daily intragastric administration of tetrapeptideLeu-Ile-Lys-Met at a dose of 12 mg/kg from 4 to 6 weeks). Oxalate nephrolithiasis was modelled using a conventional ethylene glycol model. Before starting nephrolithiasis modelling, and then every 7 days in urine, biochemical parameters of renal function were determined: diuresis, creatinine excretion and activity of marker enzymes of nephrothelial damage - lactate dehydrogenase and y-glutamyltransferase. After 6 weeks of the experiment, the rats were euthanized under ether anaesthesia and kidneys were removed for morphological assessment of the degree of intensity of stone formation. It was established that the level of diuresis in both groups throughout the experiment remained stable and did not differ between the groups. Creatinine excretion in the comparison group by the end of the experiment decreased by 2 times (p = 0,017), and remained stable in the experimental group. The activity of lactate dehydrogenase and y-glutamyltransferase in the experimental group by the end of treatment was significantly lower than the level of the comparisons group. Thus, it was found that the three-week use of the Leu-Ile-Lys-Met tetrapeptide in experimental oxalate nephrolithiasis normalizes renal function and weakens nephrocyte damage, which is accompanied by the absence of signs of stone formation in the kidneys.

Key words: Leu-Ile-Lys-Met tetrapeptide, oxalate nephrolithiasis, kidney function.

Введение

Ранее в эксперименте была показана возможность эффективного лечения мочекаменной болезни короткими пептидами. Обнаружена высокая антилитогенная активность трипептидаLeu-Ile-Lysв условиях 6-недельногои 16-недельного экспериментального оксалатного нефролитиаза [3, 4]. На основе структуры данного пептида посредством драг-дизайна были смоделированы молекулы 6 индивидуальных тетрапептидов и проведен скрининг их антилитогенной активности. Оказалось, что пептид Leu-Ile-Lys-Met в условиях смоделированного нефролитиаза обладает выраженной антиоксидантной и цитопротекторной активностью [2]. Это позволило предположить, что данный пептид может препятствовать камнеобразованию в почках, поскольку важная этиологическая роль оксидативного стресса и повреждения нефроцитов в литогенных процессах давно и хорошо известна [5, 8, 9, 13, 20]. В этой связи было решено изучить влияние тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met на функцию почек и образование почечных конкрементов у крыс при экспериментальном 6-недельном оксалатном нефролитиазе, что и явилось целью настоящего исследования.

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 20 аутбредных крысах- самцах линии Вистар возрастом 2-3 месяца и массой от 250-300 г. Животные были получены из отделения генетики животных и человека Федерального исследовательского центра «Институт цитологии и генетики» Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск). Обращение с животными осуществляли согласно Правилам надлежащей лабораторной практики (GLP) (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 01.04.2016г. №-199нг), а также требованиям Директивы 2010/63/EU по охране животных, используемых в научных целях от 22.09.2010 г.

Основная часть

На всем протяжении эксперимента крысы находились в индивидуальных метаболических клетках, приспособленных для сбора мочи, в условиях свободного доступа к питью и пище при естественном световом режиме. В соответствии с дизайном эксперимента животные были разделены на 2 группы по 10 особей в каждой:

Группа сравнения - 6 недель моделирования оксалатного нефролитиаза.

Подопытная группа - 6 недель моделирования оксалатного нефролитиаза + ежедневное введение тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met с 4 по 6 неделю.

Ранее было показано, что в процессе моделирования оксалатного нефролитиаза у крыс в моче наблюдается рост активности маркерных ферментов, в частности, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и у-глутамилтрансферазы (ГГТ), а также отложение кальциевых депозитов в области почечного сосочка, чего не зафиксировано у интактных животных [1]. В этой связи в данной работе отсутствовала необходимость включения в эксперимент группы интактных крыс в силу того, что различия в общей картине функции почек у здоровых и больных животных при моделировании оксалатногонефролитиаза известны и по этой причине предсказуемы.

Оксалатный нефролитиаз моделировали согласно общепринятой этиленгликолевой модели [6], суть которой заключается в том, что животным на протяжении эксперимента постоянно в свободном доступе предоставляется в качестве питья 1 % раствор этиленгликоля. Этиленгликоль в организме метаболизируется до оксалат-ионов, которые, выделяясь с мочой, образуют нерастворимые кристаллы оксалата кальция, провоцируя формирование почечных конкрементов.

Тетрапептид Leu-Ile-Lys-Met был получен методом синтеза на предприятии «Shanghai Apeptide Co., LTD» (г. Шанхай, КНР) при посредничестве ЗАО «Эвалар» (г. Бийск, Россия). Чистота продукта составила 98 %. Данный пептид вводили крысам внутрижелудочно через зонд в дозе 12 мг/кг.

На протяжении эксперимента до начала моделирования нефролитиаза, а затем каждые 7 дней в моче крыс обеих групп на автоматическом биохимическом анализаторе DIRUICS-T240 определяли биохимические параметры функции почек: величину диуреза, уровень экскреции креатинина и активность маркерных ферментов повреждения нефротелия - ЛДГ и ГГТ.

Концентрацию креатинина определяли кинетическим методом без депротеинизации, основанным на реакции Яффе образования красно-оранжевого окрашенного комплекса. Принцип метода определения активности ЛДГ основан на реакции восстановления пирувата до молочной кислоты, скорость реакции пропорциональна активности ЛДГ в пробе. В основе определения активности ГГТ лежит реакция переноса L-у-глутамил-З-карбокси-п-нитроанилида на глицилглицин, которая катализируется данным ферментом с образованием окрашенного 5-амино-2-нитробензоата.

По истечении 6 недель эксперимента крыс подвергли эвтаназии под эфирным наркозом и извлекли почки для морфологической оценки степени интенсивности процессов камнеобразования. Для проведения морфологических исследований почки фиксировали в 10 % растворе формалина, обрабатывали по стандартной методике, изготавливали поперечный срез толщиной 6 мкм через почечный сосочек. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Кальциевые депозиты идентифицировали гистохимическим методом Косса, при помощи компьютерной программы на снимках подсчитывали количество кальциевых депозитов в поле зрения и определяли их размер. Морфометрические исследования проводили с использованием программных пакетов ImageJ1.43 («NIH», США) и AxioVision 3.1 («Carl Zeiss», Германия).

Для статистической обработки результатов использовали компьютерную программу Statistica13.3.1 («StatSoft», США). Результаты биохимических исследований представлены медианой (Me) и интерквартильным размахом (25, 75 %). Результаты морфометрических исследований представлены средним (M) и стандартной ошибкой среднего (m). Статистические сравнения между группами осуществляли с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни, сравнения внутри группы относительно исходного уровня проводили с применением непараметрического критерия Вилкоксона. Результаты признавали достоверными при значении показателя достоверности p< 0,05, как это принято в экспериментальной фармакологии [10, 17].

Результаты исследования и их обсуждение. Результаты изучения влияния тетрапептидаLeu-Ile-Lys-Metна уровень диуреза и экскреции креатинина у крыс экспериментальных групп представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Показатели уровня диуреза и экскреции креатинина у крыс экспериментальных групп при изучении влияния тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met на функцию почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе

Примечание: ри/у - уровень статистической значимости различий соответствующего показателя внутри группы по сравнению с его исходным уровнем, рк - уровень статистической значимости различий соответствующего показателя в подопытной группе в сопоставлении с группой сравнения

Оказалось, что в группе сравнения уровень диуреза на протяжении всего эксперимента оставался стабильным, не претерпевая существенных изменений. В подопытной группе величина описываемого показателя имела некоторую тенденцию к снижению к концу периода наблюдений, однако эти изменения не носили статистически значимого характера. Статистически значимых межгрупповых различий в уровне диуреза также выявлено не было.

Динамика экскреции креатинина имела иную картину. Как следует из таблицы 1, уровень экскреции креатинина в группе сравнения на 5 и 6 неделях существенно снижался, уступая исходному уровню в 2,5 раза и в 2 раза, соответственно. На этом фоне уровень экскреции креатинина в подопытной группе на протяжении всего эксперимента оставался достаточно стабильным, не претерпевая существенных изменений. Как следствие, на 6 неделе величина описываемого показателя между группами статистически значимо различалась, в то время как в подопытной группе она была в 1,9 раза больше, чем в группе сравнения.

Результаты изучения влияния тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met на активность ЛДГ и ГГТ у крыс экспериментальных групп представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Показатели активности ЛДГ и ГГТ у крыс экспериментальных групп при изучении влияния тетрапептида Leu-Ile-Lys-Met на функцию почек при экспериментальном оксалатном нефролитиазе