По определению геронтологии, старение - это процесс, охватывающий все уровни организации одной особи, нарушение жизнедеятельности клеток и последовательно всего организма. Результат старения - прогрессивное повышение вероятности смерти. Важным свойством этого процесса является гетерогенность (вхождение в генотип одного и более аллеля одного или нескольких генов). Как следствие этого свойства в организме возникают изменения, характерные для старения. Но также в любом органе стареющего организма эти изменения переплетаются с приспособительными изменениями, которые идут на восполнение структурных и функциональных потерь, поэтому невозможно определить скорость старения всего организма в целом, рассматривая изменения в отдельно взятых его частях. Это объясняет использование в исследованиях генетики старения такого показателя, как продолжительность жизни, наследуемость которого является центром изучений науки.
В ходе исследований геронтология установила некоторые факты о продолжительности жизни и факторов, влияющих на неё.
Во-первых, продолжительность жизни зависит от вида животного и его биологии: длительность эмбрионального периода и возраст достижения половой зрелости.
Во-вторых, на ПЖ влияют соматические клетки, в которых возникли мутации, или клетки, делящиеся амитозом, то есть раковые. Раковые клетки практически всегда приводят к летальному исходу, если вовремя не остановить их развитие. Влияние мутационных изменений на организм зависит от типа мутации: если мутация оказывается полезной и закрепляется в генотипе особи, то улучшается качество жизни этой особи или увеличивается продолжительность жизни. В случае если мутация носит вредный характер, то процесс старения идёт быстрее.
В-третьих, некоторые гены с самого начала предрасположены к хроническим заболеваниям, которые передаются по наследству. В этом случае играет большую роль плейотропия (проявление более одного фенотипического признака одним геном), так как если хоть один ген окажется аутосомным, то он повлияет на всю продолжительность жизни организма в целом, она будет меньшей.
В-четвёртых, главным фактором старения являются внешние воздействия. Скорость жизнедеятельности клетки и организма в целом напрямую зависят от температуры, двигательной активности особи, химического состава окружающей среды, уровня радиации.
Одним из главных процессов в клетке является репликация ДНК. Осуществляется этот процесс с помощью ДНК-полимеразы, специального белка, разрезающего генетическую спираль. Особенность этого процесса заключается в том, что при дупликации полимераза урезает часть ДНК, которая потом не восстанавливается, что сокращает продолжительность жизни клетки.
Есть статистические данные, что превышение родителями средней продолжительности жизни на 10 лет добавляет к жизни детей 1 год. Однако геронтология установила, что нет специальной программы старения, в генетическом материале не «записано» время старения и смерти, несмотря на то, что процесс старения находится под генетическим контролем путём изменения его скорости. В исследованиях зависимости скорости старения от условий жизни, проводимых на лабораторных животных, используют следующие показатели:
1) Состояния белков соединительной ткани коллагена и эластина;
2) Сердечной деятельности и кровообращения;
3) Содержания пигмента липофусцина (бурый пигмент, содержащийся в неделящихся клетках (нейронах, клетках сердечных тканей), при старении организма или каких-либо патологиях его концентрация повышается) в клетках нервной системы и сердца;
4) Произвольной двигательной активности;
5) Способности к обучению
Есть версия, что ограниченный рацион положительно влияет на продолжительность жизни организма, увеличивая её. Чтобы проверить эту теорию, украинскими учёными, А. М. Вайсерманом, Е. А. Федоренко, Н. М. Кошелем, Л. В. Меховой, А. В. Писаруком, А. И. Бажиновой, А. К. Колядой, О. Г. Забугой, В. П. Войтенко, были проведены исследования на Drosophila Melanogaster дикого типа Oregon-R. Они уменьшали концентрацию питательных веществ на 90, 80, 70, 60, 40, 30, 20 и 10% и сравнивали полученные результаты с нормой (100% содержания питательных веществ). Они получили следующие результаты:
· Снижение содержания ПВ в корме мух до 40% не влияло на длительность их развития;
· У мух, развивавшихся на среде с дефицитом ПВ более 40 %, выявлено существенное увеличение длительности развития;
· Уменьшение концентрации ПВ в среде до 30% практически не изменяло количество выживших мух, но при развитии на наиболее обедненной питательной среде (10% и 20 % нормы), обнаружено значительное увеличение смертности мушек; в частности, на 10% среде выживала примерно только половина особей.
2. Практическая часть
2.1 Цели, задачи и методы эксперимента
Цель нашей исследования - выявить влияние различной концентрации питательных веществ на выживаемость и плодовитость дрозофил с некоторыми мутациями. Для проведения эксперимента мы использовали две мутации плодовых мушек Drosophila Melanogaster: с нормальным, обычным генотипом и с мутацией White (Белые Глаза).
Рис.1 Дрозофилы с нормальным генотипом (справа) и дрозофилы с мутацией белые глаза (слева)
Рис.2 Дрозофилы с мутацией белые глаза
Рис.3 Дрозофилы с нормальным генотипом
Для достижения нашей цели мы поставили себе следующие задачи:
1. Выбрать один из известных вариантов приготовления питательной среды для выращивания дрозофил: наиболее легкий, быстрый и доступный по ингредиентам.
2. Отработать механизм пересаживания дрозофил из одной пробирки в другую.
3. Уметь определять пол мух для точного их подсчёта, отбирать особей, наиболее подходящих для дальнейшего развития.
4. Изучить влияние ограничения количества питательных веществ в среде на плодовитость, скорость развития и выживаемость двух мутаций дрозофил.
5. Анализировать все получаемые результаты, выявлять зависимость количества потомства и его выживаемость от типа мутации и концентрации питательных веществ в среде.
2.2 Приготовление питательной среды
1. Приготовление питательной среды
Было предложено три рецепта приготовления:
1-ый РЕЦЕПТ. Главным элементом данной смеси являются дрожжи и вода, дополнительными элементами - сахар, изюм или меласса. Чтобы смесь имела желеобразную консистенцию, в нее добавляют агар или желатин. Необходимо соблюдать следующие пропорции:
- дрожжи - 60 гр;
- изюм - 40 гр;
- агар (или желатин) - 6 гр;
- манная крупа - 40 гр;
- вода - 1 л.
Смесь варят 1,5 часа, затем охлаждают и разливают по сосудам, после чего по поверхности разбрызгивают суспензию дрожжей. Для приготовления суспензии берут дрожжи, взбалтывают, и пока клетки дрожжей не осели, разбрызгивают приготовленную смесь. Поскольку личинки дрозофил быстро разжижают смесь и могут в ней утонуть, через 5-6 дней на поверхность питательного субстрата кладут куски поролона. Можно сделать смесь более плотной за счет увеличения количества агара (до 10-12 гр), тогда надобность в поролоне отпадает.
2-ый РЕЦЕПТ. Составляющие части:
- дрожжи - 30 гр;
- агар (или желатин) - 10 гр;
- манная крупа - 110 гр;
- сахарный сироп - 30 гр;
- вода - 1 л.
Для приготовления смеси манную крупу размешивают с водой, добавляют агар, дрожжи и сироп. Смесь уваривают на слабом огне, охлаждают и разливают по сосудам слоем высотой около 2 см. Периодическое разбрызгивание по поверхности этого субстрата суспензии дрожжей стимулирует откладывание яиц дрозофилами. На одной порции смеси можно вырастить 2-3 поколения мушек. Для такой питательной среды нет необходимости в поролоне, поскольку мы увеличили количество желатина (агара). Поролон может препятствовать вылуплению личинок и их выходу на поверхность питательной среды.
3-ый РЕЦЕПТ. Составляющие части:
- дрожжи - 90 гр;
- агар (или желатин) - 15 гр;
- меласса - 90 гр;
- вода - 1 л.
В питательную среду можно также добавлять измельчённые кусочки фруктов (яблок, банан, груш), сладкую рисовую или пшенную кашу и т. д. Смесь уваривают до однородной массы, охлаждают, разливают по пробиркам.
Мы остановились на втором рецепте, так как он оказался самый эффективный: легко готовится, быстро застывает, среда получается не слишком жидкая для мух.
Другие рецепты либо были более трудоемкими, либо некоторые ингредиенты трудно найти в магазине (например, мелассу).
Также на выбор повлияло то, что приготовленная нами среда была похожа по составу на изначальную, в которой находились привезённые из МГПУ дрозофилы. На этой среде дрозофилы жили около недели, после недели среда стала подсыхать и портиться.
2.3 Пересаживание дрозофил
Пересаживание дрозофил
Для пересадки в другие пробирки с питательной средой мух надо сначала усыпить. В качестве усыпляющего средства мы использовали диэтиловый эфир (Н5С2-О-С2Н5). При работе с диэтиловым эфиром важно соблюдать правила безопасности: не допускать попадания эфира на поверхность кожи и слизистых, избегать излишнего испарения эфира, так как, попадая через дыхательные пути в организм человека, может вызывать отравление. А так как дрозофилам хватало буквально капли эфира, чтобы заснуть, мы использовали обыкновенный медицинский шприц с иголкой, потому что игла легко проникала сквозь ватный слой, и можно было дозировать количество эфира. В случае если мухи не засыпали, мы помещали ватку, пропитанную диэтиловым эфиром в пробирку. Когда мушки засыпали, мы выкладывали их на стол и подсчитывали количество особей мужского и женского пола. Процесс первой пересадки проходил так: мы капнули каплю диэтилового эфира в пробирку, дождались, пока все мухи не упали на дно пробирки и не уснули, затем мы высыпали их на стол, подсчитали количество особей мужского и женского пола и пересадили попарно каждой особи в несколько пробирок.
Большинство пересаживаний таким образом проходили удачно, однако бывали случаи, когда дрозофилы долго находились в активном состоянии, и их приходилось усыплять большим количеством диэтилового эфира.
2.4 Определение пола дрозофил
Определение пола дрозофил.
Различить дрозофил по полу несложно: у самок длинное белое брюшко, у самцов короткое и серое/чёрное.
Рис.4 Сравнение мужской и женской особей дрозофил
Внешне самки и самцы дрозофилы очень различаются. Самки крупнее самцов: в длину они достигают максимум 5 мм, в то время как самцы - всего лишь 2-3 мм. Брюшко у самки удлиненное и несколько округлое с заостренным концом. Самцы дикого типа дрозофил имеют небольшое цилиндрическое брюшко с тупым концом, которое окрашено в серо-черный цвет. Дикий тип дрозофил также имеет красные глаза и нормальные крылья, то есть их признаки представлены доминантными генами.
Drosophila White практически ничем не отличаются по внешности от Drosophila Melanogaster, за исключением цвета глаз: у мушек с нормальным генотипом они красного цвета, у мутантных - бесцветные. За выработку пигментов цвета глаз дрозофил отвечает несколько генов. Если же в одном из этих генов возникает мутация, влияющая на выработку пигмента (в диком типе цвет глаз - смесь красных и коричневых пигментов), то цвет глаз проявляется как белый.
Рис.5 Сравнение мушек с нормальным генотипом и мутацией Белые Глаза
После подсчёта мы отбирали наиболее здоровых, как нам казалось, дрозофил и сажали в новую среду. Сначала мы сажали каждую мутацию группами (по 6-8 особей сразу). Но для такого количества мух и их потомства пространство было слишком маленьким, и они в скором времени могли погибнуть. Тогда мы сажали их попарно, но и это оказалось неудачей, так как не всегда мухи скрещивались и давали потомство. Оптимальным оказалось помещать дрозофил по 2 самца и 2 самки, так больше вероятности получения потомства и снижение избыточного количества особей в среде. Это оказалось также оптимальным вариантом потому, что пространство для мух было небольшим и самих пробирок было ограниченное количество.
Условия для содержания дрозофил должны быть определеными. Температура не должна превышать 25?С, иначе мушки погибнут; при более низких температурах - затормозятся процессы жизнедеятельности мушек. Также воздух не должен быть слишком влажным, так как повышенная влажность - отличная среда для развития спор плесневых грибов, а они могут проникать куда угодно. Не смотря на соблюдение условий разведения дрозофил, иногда в пробирке с питательным субстратом и дрозофилами появлялась плесень, что являлось большой проблемой. Мы предпринимали меры по удалению плесени: пересаживали мух в другую чистую пробирку, но в большинстве случаев это не помогало, так как плесневые грибы переносились вместе с мухами, и среда заражалась снова. Заплесневевшие пробирки приходилось выбрасывать. Изучив диплом Екатерины Воробьёвой, мы узнали, что в борьбе с плесенью можно использовать пропионовую кислоту (Н3С-СН2-СНООН), добавляя её в питательную смесь. Она убивает споры плесневых грибов.
2.5 Изменение концентрации питательных веществ
Изменение концентрации питательных веществ.
В течение трёх месяцев мы вырастили несколько поколений мух на нормальной среде, наблюдали за скоростью развития и количеством потомков. Дрозофилы с мутацией «Белые Глаза» погибли раньше, чем мы ожидали. Точных причин мы не можем установить, но есть предположение, что причиной гибели стал тот факт, что организм с какой - либо мутацией слабее организма с нормальным генотипом (если только эта мутация не является полезной). В январе эксперимент перешел на следующий уровень - с изменением концентрации питательных веществ в среде: мы уменьшали процент содержания манной крупы как основного источника питательных веществ на 15%, 30% и 50%; и смотрели на влияние изменений: меняется ли длительность жизни, количество потомков, и количество невылупившихся из куколок мух; пытались выявить закономерность получаемых результатов от концентрации питательных веществ в среде. Условия развития мух были одинаковы и соответствовали контрольной группе, пересаживали дрозофил по отработанной схеме. Мы приготовили по четыре пробирки с разной концентрацией субстрата, пересадили по четыре особи в каждую пробирку и наблюдали за развитием дрозофил, продолжительностью их жизни и количеством потомков.