Препараты ВВИГ, различающиеся составом и технологиями производства при добавлении индуктора зимозан к лейкоцитам крови крыс, оказывали активирующее влияние, выраженное в разной степени (рисунок 2).
Рисунок 2 - Уровень индуцированной зимозаном хемилюминесценции лейкоцитов крови крыс после предварительной инкубации с препаратами внутривенных иммуноглобулинов
Примечание - * различие с контролем статистически значимо (P?0,05).
Как видно из рисунка, препараты Иммуновенин и обогащенный IgM и IgA Пентаглобин вызывали достоверно выраженную активацию фагоцитов крови, в то время как для Хумаглобина такая активация не была достоверной.
Для полной характеристики состояния фагоцитов при воздействии ВВИГ необходимо иметь представление об изменении емкости их функционального резерва (таблица 4).
Таблица 4 - Изменения относительной емкости функционального резерва фагоцитарных клеток крови крыс при воздействии препаратов внутривенных иммуноглобулинов
|
Препарат |
Imax ind - Imax sp, у. е |
Imax ind - Imax sp Imax sp |
Относительная емкость резерва фагоцитов крови, % |
|
|
Контроль (n=10) |
1,03±0,08 |
1,45±0,25 |
100 |
|
|
Иммуновенин (n=10) |
1,73±0,15* |
2,46±0,05* |
169,7* |
|
|
Хумаглобин (n=10) |
2,35±0,31* |
2,30±0,20* |
158,6* |
|
|
Пентаглобин (n=10) |
2,10±0,04* |
2,65±0,15* |
182,7* |
* - различие с контролем статистически значимо (p0,05).
Как следует из таблицы 4, относительная емкость резервных возможностей фагоцитов крови при воздействии ВВИГ значительно увеличилась (в среднем на 70 %).
Далее было изучено влияние ВВИГ на кислород-зависимую функционально-метаболическую активность и генерацию АФК фагоцитарными клетками, обладающими повышенным начальным уровнем активации (стимулированные фагоциты).
Все исследованные препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения вызывали достоверное увеличение показателей активированных ПМЯЛ в отношении объектов фагоцитоза (таблица 5).
Таблица 5 - Уровень хемилюминесценции активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс индуцированной зимозаном, латексом или стафилококком после предварительной инкубации клеток с препаратами внутривенных иммуноглобулинов
|
Препарат |
Светосумма ХЛ (у.е.) при индукции: |
|||
|
зимозаном |
латексом |
стафилококком |
||
|
Без препаратов (n=10) |
1,220,15 |
5,340,92 |
33,936,14 |
|
|
Иммуновенин (n=10) |
4,571,43* |
8,200,56* |
60,169,82* |
|
|
Хумаглобин (n=10) |
3,540,44* |
6,481,07 |
56,187,03* |
|
|
Пентаглобин (n=10) |
5,051,48* |
6,211,51 |
58,988,92* |
*- различие с контролем статистически значимо (P0,05).
Защитную активность и генерацию АФК в отношении зимозана стафилококков достоверно усиливали все препараты, в то время как реакцию с инородными корпускулярными частицами не биологической природы - микросферами латекса (взаимодействие опосредуется лектиноподобными рецепторами мембран фагоцитов) только Иммуновенин.
Следующим этапом работы стала оценка влияния различных концентраций ВВИГ на функционально-метаболическую активность разных типов фагоцитарных клеток и генерацию ими АФК.
По полученным данным, воздействие препаратов ВВИГ в разных концентрациях на кислород-зависимый метаболизм, генерацию АФК интактными полиморфно-ядерными лейкоцитами крови крыс и человека характеризовалось одинаковыми закономерностями (таблица 6).
Таблица 6 - Показатели хемилюминесценции полиморфно-ядерных лейкоцитов крови крыс и человека после инкубации с препаратами внутривенных иммуноглобулинов в разных концентрациях
|
Объект исследования |
Концентрации препаратов |
Иммуновенин |
Хумаглобин |
Пентаглобин |
|
|
Лейкоциты крови крыс (n=10) |
Контроль |
2,24±0,41 |
2,24±0,41 |
2,24±0,41 |
|
|
0,05 мг/мл |
2,01±0,14 |
1,99±0,05 |
2,50±0,44 |
||
|
0,25 мг/мл |
3,37±1,12 |
2,01±0,28 |
2,53±0,18 |
||
|
1,25 мг/мл |
3,26±0,11* |
4,04±0,54* |
3,28±0,02* |
||
|
5 мг/мл |
8,12±3,72 |
5,34±0,98* |
2,15±0,01 |
||
|
12,5 мг/мл |
1,14±0,13* |
2,58±0,40 |
0,37±0,02* |
||
|
25 мг/мл |
0,63±0,30* |
1,03±0,12* |
0,40±0,06* |
||
|
Лейкоциты крови человека (n=10) |
Контроль |
3,54±0,26 |
3,54±0,26 |
3,54±0,26 |
|
|
0,05 мг/мл |
3,41±0,10 |
3,17±0,41 |
3,27±0,03 |
||
|
0,25 мг/мл |
3,22±0,41 |
3,54±0,91 |
3,07±0,44 |
||
|
1,25 мг/мл |
5,34±0,04* |
5,87±0,41* |
2,87±0,61 |
||
|
5 мг/мл |
6,03±0,31* |
3,62±0,71 |
5,36±0,50* |
||
|
12,5 мг/мл |
1,64±0,35* |
3,14±0,89 |
2,86±0,95 |
||
|
25 мг/мл |
1,54±0,15* |
1,82±0,34* |
1,78±0,35* |
* - различие с контролем статистически значимо (p0,05).
Дозы в 0,05-0,25 мг/мл не оказывали влияния на интенсивность ХЛ, а 1,25 мг/мл вызывали усиление свечения образцов. Более высокие дозы препаратов ВВИГ (5-25 мг/мл) оказывали различные по направлению воздействия на ХЛ клеток. Иммуновенин и Пентаглобин в концентрации 5 мг/мл повышали интенсивность ХЛ крови человека, тогда как усиление ХЛ крови крысы вызывал только Хумаглобин. Добавление высоких доз 12,5-25 мг/мл препаратов оказывало противоположно направленное воздействие - то есть подавляло свечение клеток крови, отражающее снижение генерации АФК клетками.
Показатели НСТ-теста в той или иной степени повторяли изменения светосумм ХЛ, однако в диапазоне доз 0,05-0,25 мг/мл показатели НСТ-теста практически не менялись. Влияние ВВИГ в НСТ-тесте проявлялось в дозах 5-25 мг/мл (рисунок 3).
A Б
Рисунок 3 - Показатели НСТ-теста полиморфно-ядерных лейкоцитов крови к - крыс, ч - человека: А - процент позитивных клеток, Б - индекс активации, при добавлении препаратов внутривенных иммуноглобулинов в дозах 5 мг/мл; 12,5 мг/мл; 25 мг/мл.
*- различие с контролем статистически значимо (p<0,05).
Препараты воздействовали сходным образом на показатели НСТ-теста: усиливающее влияние в концентрации 5 мг/мл (в 1,5 раза от контроля) и подавляющее в дозе 25 мг/мл (снижение в 1,5-2 раза).
Следовательно, препараты ВВИГ в зависимости от используемой концентрации способны стимулировать либо подавлять процессы генерации АФК фагоцитами крови.
Изучение влияния исследуемых ВВИГ на ХЛ резидентных перитонеальных макрофагов выявило снижение значений исследуемых концентраций (таблица 7).
Таблица 7 - Показатели светосумм резидентных перитонеальных макрофагов крыс после инкубации с препаратами внутривенных иммуноглобулинов в разных концентрациях
|
Объект исследования |
Концентрации препаратов |
Иммуновенин |
Хумаглобин |
Пентаглобин |
|
|
Резидентные перитонеальные макрофаги крыс (n=10) |
Контроль |
3,40±0,22 |
3,40±0,22 |
3,40±0,22 |
|
|
0,05 мг/мл |
1,55±0,16* |
2,14±0,09* |
1,41±0,25* |
||
|
0,25 мг/мл |
1,62±0,15* |
1,42±0,02* |
0,69±0,02* |
||
|
1,25 мг/мл |
1,26±0,49* |
0,92±0,32* |
0,93±0,31* |
||
|
5 мг/мл |
0,94±0,48* |
0,42±0,06* |
0,81±0,11* |
||
|
12,5 мг/мл |
0,77±0,50* |
0,45±0,18* |
0,38±0,28* |
||
|
25 мл/мл |
0,23±0,11* |
0,38±0,28* |
0,28±0,11* |
* - различие с контролем статистически значимо (p0,05).
Параметры НСТ не менялись при добавлении низких концентраций ВВИГ. Только высокие дозы этих препаратов угнетали значения НСТ-теста в 1,5-2 раза (рисунок 4), что может быть связано с меньшей чувствительностью этого показателя в сравнении с регистрацией ХЛ.
А Б
Рисунок 4 - Показатели НСТ-теста перитонеальных интакных макрофагов крыс: А - процент позитивных клеток, Б - индекс активации, при добавлении препаратов внутривенных иммуноглобулинов в различных дозах.
Примечание: *- различие с контролем статистически значимо (p<0,05).
Таким образом, препараты внутривенных иммуноглобулинов подавляют генерацию АФК интактными макрофагами крыс.
Воздействие ВВИГ на ХЛ ПМЯЛ из очага воспаления крыс характеризовалось сходными закономерностями, сопоставимыми с влиянием ВВИГ на интактные ПМЯЛ крови: в низких концентрациях (0,25-1,25 мг/мл) они усиливали генерацию фагоцитами АФК, а в высоких (12,5-25 мг/мл) - ее подавляли. Выявленное зависимое от дозы разнонаправленное проявление биологической активности препаратов ВВИГ можно характеризовать как модулирующее. Интенсивность стимулирующего влияния низких концентраций препаратов существенно различалась (рисунок 5).
Рисунок 5 - Модулирующее влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на кислород-зависимый метаболизм активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс по данным регистрации хемилюминесценции
Так, Пентаглобин, отличающийся значительным содержанием иммуноглобулинов классов IgM и IgA, вызывал усиление ХЛ фагоцитов уже начиная с минимальной использованной концентрации (0,05 мг/мл), в то время как препараты Иммуновенин и Хумаглобин, представленные в подавляющем количестве IgG, в данной дозе не оказывали стимулирующего влияния на активность фагоцитарных клеток. ВВИГ в концентрациях 0,25 мг/мл и в еще большей степени 1,25 мг/мл - стимулировали данные процессы. Дозы в 5 мг/мл не оказывали достоверного влияния на определявшиеся показатели полиморфно-ядерных лейкоцитов, а в концентрациях 12,5 мг/мл и 25 мг/мл препараты в равной степени вызывали угнетение кислород-зависимого метаболизма, генерации АФК.
Изучение воздействия ВВИГ на процессы кислород-зависимого метаболизма мононуклеарных активированных фагоцитов, полученных из очага воспаления, выявило однонаправленный характер и было сопоставимо с влиянием ВВИГ на генерацию АФК интактными перитонеальными макрофагами крыс. Уже в минимальной использованной концентрации, данные препараты вызывали угнетение ХЛ (рисунок 6).
Рисунок 6 - Влияние препаратов внутривенных иммуноглобулинов на кислород - зависимый метаболизм активированных перитонеальных мононуклеарных фагоцитов крыс по данным регистрации хемилюминесценции
В диапазоне доз 1,25-25 мг/мл ВВИГ вызывали подавление процессов генерации АФК как по данным ХЛ, так и по показателям НСТ-теста.
Таким образом, влияние ВВИГ in vitro на мононуклеарные активированные фагоциты крыс носило угнетающий характер, в целом, в равной степени выраженный для всех исследуемых препаратов, в то время как в экспериментах по изучению прямого влияния ВВИГ на функции ПМЯЛ in vitro была выявлена модулирующая способность препаратов: в низких дозах усиливать и в высоких - подавлять процессы кислород-зависимого метаболизма и генерации АФК.
Выявленные закономерности модулирующего влияния ВВИГ подтвердились при введении разных доз препарата животным в опытах in vivo. После введения животным Иммуновенина в дозе 250 мг/кг уровень ХЛ клеток повышался (в 1,4 раза в сравнении с контролем) (таблица 8).
Таблица 8 - Показатели активности кислород-зависимого метаболизма активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс из очага воспаления после воздействия Иммуновенина in vivo
|
Введение препарата Иммуновенин в дозах |
Показатели НСТ-теста |
Светосумма ЛЗХЛ (у.е.) |
||
|
Процент НСТ |
Индекс активации |
|||
|
Контроль (без ИВ) (n=10) |
75,21+2,49 |
1,18+0,08 |
12,35+0,76 |
|
|
250 мг/кг (n=10) |
82,60+4,90 |
1,10+0,10 |
16,43+1,50* |
|
|
1250 мг/кг (n=10) |
57,14+7,14* |
0,76+0,07* |
6,22+0,82* |
* - различие с контролем статистически значимо (p0,05).
Используемая доза соответствовала низким (1,25-5 мг/мл) концентрациям препарата в пересчете на применяемые концентрации в in vitro эксперименте.
Введение крысам Иммуновенина в дозе 1250 мг/кг вызывало противоположно направленное изменение активности - снижение свечения ПМЯЛ в 2 раза в сравнении с контролем. В пересчете на используемые в эксперименте in vitro исследуемая доза соответствовала высоким концентрациям (12,5 мг/мл) препарата. Снижение кислород-зависимого метаболизма наблюдалось также и в НСТ - тесте.
Таким образом, по данным ХЛ, как и в in vitro экспериментах разнонаправленные эффекты ВВИГ были выявлены in vivo: активация генерации АФК в низких и подавление кислород-зависимого метаболизма фагоцитов в высоких дозах. В то же время, действие препарата in vivo проявлялось менее выражено. Это может быть объяснено тем, что действие ВВИГ у животных in vivo осуществлялось не в результате прямого воздействия препарата на клетки как в эксперименте in vitro, а имело опосредованный характер.