Автореферат: Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов

Воздействие препаратов in vitro на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными полиморфно-ядерными лейкоцитами из крови и перитонеального экссудата характеризуется дозозависимыми разнонаправленными изменениями их кислород-зависимой активности: низкие концентрации препаратов ее стимулируют, а высокие - подавляют. Влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на генерацию интактными и активированными перитонеальными мононуклеарными фагоцитами из экссудата характеризуется однонаправленным характером: как низкие, так и высокие дозы препаратов угнетают процессы кислород-зависимого метаболизма.

Введение экспериментальным животным внутривенных иммуноглобулинов (Иммуновенин) в разных концентрациях оказывает разнонаправленное воздействие на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами из очага воспаления, аналогичное воздействию препарата на фагоциты in vitro.

Апробация работы

Материалы исследований представлены на I Международной (Х Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006), научно-практической конференции с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2006, 2007, 2008), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Озон в биологии и медицине» (Нижний Новгород, 2007), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).

Апробация диссертации проведена на расширенном заседании научно-технического совета Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации (протокол № 18 от 28.10.08); на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 (протокол № 2 от 24.11.08).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 в изданиях журналов, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 116 страницах, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа содержит 14 таблиц, 23 рисунка, 2 схемы. Список литературы включает 214 источников (106 отечественных и 108 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В данной работе изучалось влияние препаратов ВВИГ на функциональную и метаболическую активность фагоцитов и процессы образования свободных радикалов in vitro, оценивались перспективы использования хемилюминесцентных методов исследования для изучения фагоцитарных механизмов и определения биологических свойств иммуноглобулиновых препаратов крови. Общая характеристика проведенного исследования представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Общая характеристика проведенного исследования

В работе были использованы препараты нормальных донорских иммуноглобулинов для внутривенного введения, различающиеся по технологиям получения и составу - Иммуновенин производства Филиала ФГУП “НПО “Микроген” МЗ и СР РФ “Иммунопрепарат”, г. Уфа, Хумаглобин (Human Serum Production and Medicine Manufacturing CoLtd, Венгрия) и Пентаглобин (Biotest Pharma GmbH, Германия).

Регистрацию свечения проводили на приборе хемилюминомер «ХЛМ-003» (производитель - Уфимский государственный авиационный технический университет). В качестве наиболее информативных показателей ХЛ были взяты светосумма - S и максимальная амплитуда медленной вспышки - Imax [Фархутдинов Р.Р. и др., 2005].

Прямое влияние препаратов ВВИГ на процессы генерации свободных радикалов in vitro оценивали в модельных системах. В качестве первой модели использовали фосфатный буфер (KH2PO4 - 20 мM, KCl - 105 mM, рH 7,45 ед.), с добавлением цитрата натрия (50 мМ) и люминола (5-амино, 2-3-дегидро-4-фталазиндион, 10-5 М). Для оценки антиокислительной активности препаратов ВВИГ на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), была использована вторая модельная система, содержащая липидно-белковые комплексы из гомогенизированного куриного желтка [Харитонов В.В. и др., 2004], а также плазма крови человека (третья модельная система). Образование свободных радикалов инициировали введением 1 мл раствора сернокислого железа (FeSO4.7H2O - 50 мМ) в 19 мл исследуемого образца при постоянном перемешивании. Реакция сопровождалась ХЛ. Свечение регистрировалось в течение 5 минут. Антиокислительную активность препаратов определяли по угнетению ХЛ модельных систем, результаты выражали в процентах от контроля [Фархутдинов Р.Р. и др., 2005].

Для исследования влияния препаратов на функционально-метаболическую активность и генерацию АФК фагоцитами при добавлении стимуляторов-объектов фагоцитоза использовали гепаринизированную кровь (из расчета 50 ЕД гепарина на 1 мл) интактных животных и суспензию ПМЯЛ из очага воспаления крыс, вызванного внутрибрюшинным введением 20 мл стерильного 8 % пептона через сутки (“спровоцированные ” ПМЯЛ). Кровь интактных крыс и суспензии ПМЯЛ разливали в лунки 96-луночного пластикового планшета. К образцам добавляли препараты ВВИГ в конечных концентрациях 5 мг/мл. После предварительной инкубации при 37 оС в течение 30 минут во все лунки добавляли по 0,01 мл суспензий с объектами фагоцитоза - микросферы латекса, частицы зимозана, живые клетки из культуры стафилококка в концентрации 1010 частиц/л и дополнительно инкубировали при 37 оС в течение 15 минут. Интенсивность генерации фагоцитами АФК определяли с помощью регистрации уровня люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) [Фархутдинов Р.Р. и др., 2005]. Изучая ХЛ ответ фагоцитов крови на стимуляторы фагоцитоза, представлялось целесообразным исследовать резервные возможности фагоцитирующих клеток крови. Для оценки емкости резерва функциональной активности фагоцитов крови применялась формула, показывающая кратность отношения резерва к спонтанному свечению [Тевдорадзе С.И., 2006]: Х = ( Iind - Isp ) \ Isp, где Х - соотношение резерва функциональной активности к спонтанному свечению фагоцитов крови; Iind - максимальная интенсивность индуцированного свечения крови, Isp - максимальная интенсивность спонтанного свечения крови. В материале из параллельных лунок исследуемых и контрольных образцов определяли поглотительную способность фагоцитов и индуцируемую активацию кислород - зависимого метаболизма фагоцитов - НСТ тест [Имельбаева Э.А. и др., 2006].

Для изучения действия разных концентраций ВВИГ на активность фагоцитарных клеток разных типов и генерации ими АФК были использованы интактные и активированные клетки. Действие препарата на интактные фагоцитарные клетки тестировалось по изменению функционально-метаболических показателей клеток венозной крови крыс и людей, промывной перитонеальной жидкости (резидентные тканевые макрофаги) интактных крыс.

Для оценки действия препаратов на активированные фагоцитарные клетки у крыс моделировали процесс воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением 20 мл стерильного 8 % раствора пептона. После инъекции из очага асептического воспаления путем отбора перитонеального экссудата получали через сутки “спровоцированные ” ПМЯЛ, через трое суток “спровоцированные ” мононуклеарные фагоциты (МФ) [Тевдорадзе С.И., 2006]. К образцам биологических жидкостей, содержащим фагоцитирующие клетки и гепарин (50 ЕД/мл), добавляли препараты ВВИГ в разных концентрациях: 0,05-5 мг/мл - соответствующих иммунокорригирующим дозам и в высоких («подавляющих активность») концентрациях 25-50 мг/мл - соответствующих применяемым дозам при курсовом лечении больных с признаками выраженной острой воспалительной реакции (тяжелые травмы, септические состояния и другие) [Сибиряк С.В. и др., 1999; Гизатуллин Р.Х. и др., 2004]. Выбранные дозы соответствуют принятым в фармакологической практике: в опытах in vitro лечебные дозы препаратов ввиду возможной нейтрализации или метаболизации в организме, десятикратно завышаются.

Исследуемые образцы суспензий клеток в пластиковых пробирках типа «Эппендорф» инкубировали в течение 24 часов при 24 °С. Определяли спонтанную активацию процессов кислородзависимого метаболизма по восстановлению нитросинего тетразолия (спонтанный НСТ-тест) после 15-минутной инкубации общепринятым методом и интенсивность генерации фагоцитами АФК методом регистрации люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ).

Следующим этапом работы было исследование влияния ВВИГ (Иммуновенин) на кислород-зависимую активность, генерацию АФК фагоцитами in vivo. Опыты проведены на 30 крысах-самках массой 180-200 грамм. Животные были разделены на 3 группы по 10 животных в каждой. Крысам вводили внутрибрюшинно раствор пептона, как было описано выше, с целью развития воспалительного процесса. Животные первой группы служили контролем. Крысам второй и третьей групп в день инъекции пептона вводили однократно внутримышечно препарат ВВИГ - Иммуновенин в дозах 250 мг/кг и 1250 мг/кг соответственно.

Через сутки животных декапитировали с соблюдением методических рекомендаций по их выведению из эксперимента и эвтаназии [Западнюк И.П. и др., 1984]. Путем промывания перитонеальной полости получали суспензию клеток - полиморфно-ядерных лейкоцитов - ПМЯЛ. Определяли их кислород-зависимую метаболическую активность с помощью регистрации ХЛ и НСТ-теста.

Оценка достоверности результатов проводилась с применением пакета программ Statistica v. 6.0 (StatSoft). За вероятность различий принимались значения при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы проводили исследование влияния препаратов ВВИГ на процессы СРО в модельных системах. При введении в модельные системы препаратов в концентрации 0,5 мг/мл уменьшалась интенсивность ХЛ. С увеличением концентрации препаратов угнетение ХЛ усиливалось (рисунок 1).

АБВ

Рисунок 1 - Влияние Иммуновенина на хемилюминесценцию модельных систем: А) активных форм кислорода; Б) куриного желтка; В) плазмы крови человека. 1 - контроль; 2 - добавлен Иммуновенин 0,5 мг/мл; 3 - добавлен Иммуновенин 5 мг/мл.

Снижение максимальной амплитуды и светосуммы свечения, по сравнению с контрольными образцами в дозе 5 мг/мл, в большей степени было выражено в системе желточных липопротеидов, соответствующих по составу липопротеидам крови низкой и очень низкой плотности (таблица 2).

Таблица 2 - Влияние препаратов внутривенных иммуноглобулинов на параметры хемилюминесценции модельных систем

* - различие с контролем статистически значимо (P0,05).

Следовательно, препараты ВВИГ способны непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами: подавлять генерацию АФК и выработку перекисных радикалов липидов.

Интерес представляет изучение влияния ВВИГ на генерацию АФК и функционально-метаболическую активность фагоцитов при добавлении стимуляторов - объектов фагоцитоза in vitro. В связи с этим были проведены исследования влияния препарата Иммуновенин при добавлении к ПМЯЛ различных объектов фагоцитоза.

Предварительная инкубация лейкоцитов крови интактных крыс с препаратом Иммуновенин в концентрации 5 мг/мл увеличивала продукцию АФК на стимуляторы фагоцитоза (таблица 3).

Таблица 3 - Изменения функционально-метаболической активности полиморфно-ядерных лейкоцитов крови крыс после предварительной инкубации с препаратом Иммуновенин

*- различие с контролем статистически значимо (P0,05).

Активирующее влияние Иммуновенина на генерацию АФК, регистрируемую в реакции ХЛ отмечалось параллельно с увеличением интенсивности поглощения фагоцитами объектов фагоцитоза и уровня активации лейкоцитов в НСТ - тесте. При этом стимулирующее влияние на фагоциты затрагивало качественные (фагоцитарный показатель и индекс активации в НСТ-тесте в каждом из активных фагоцитов), а не количественные показатели функционально-метаболической активности фагоцитов.