На правах рукописи
14.00.36 - аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ И ГЕНЕРАЦИЮ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ
Мочалов Константин Сергеевич
Уфа - 2009
Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации.
Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Медведев Юрий Анатольевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Веселов Станислав Юрьевич кандидат биологических наук, с.н.с. Курчатова Нелли Наилевна
Ведущая организация - ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Росздрава
Защита состоится 2009 г. в часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Росздрава по адресу: г. Уфа, 450000, ул. Ленина 3
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Росздрава по адресу: г. Уфа, 450000, ул. Ленина 3
Автореферат разослан 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Лукманова К.А.
иммуноглобулин свободный радикал кислород
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Среди наиболее эффективных средств, используемых в различных областях медицины, важное место продолжают занимать препараты иммуноглобулинов, в том числе и для внутривенного введения (ВВИГ). Широкое применение ВВИГ определяет необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых методов их лечебно-профилактического использования, определения разных сторон биологической активности данных препаратов, оценки их эффективности при разной патологии. Известно, что ВВИГ обладают иммуномодулирующим и противовоспалительным действием, механизмы которых полностью не прояснены [Добрица В.П. и др., 2001; Sapir T. et al., 2005].
В настоящее время продолжает оставаться актуальным исследование про-цессов фагоцитоза, характеризующих наряду с другими защитными механизмами иммунной системы способность организма противостоять инфекционным и другим факторам, в том числе вызывающим заболевания воспалительного характера [Медведев Ю.А. и др., 1999; Долгушин И.И. и др., 2001; Djaldetti M. et al., 2002; Dale D.C. et al., 2008; Kantari C. et al., 2008].
Препараты иммуноглобулинов могут оказывать разноплановое действие. Одним из важнейших свойств этих биопрепаратов является способность влиять на разные виды клеток, и в том числе стимулировать процессы фагоцитоза [Сибиряк С.В. и др, 1999; Медведев Ю.А. и др., 2000; Nilsdotter-Augustinsson A. et al., 2004]. Вместе с тем известно, что препараты ВВИГ обладают противовоспалительным действием, одним из компонентов которого является угнетение различных проявлений фагоцитарной активности клеток [Stangel M. et al., 2000]. Так, препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения используются для купирования системного воспалительного ответа [Белобородов В.Б. и др., 2000; Гизатуллин Р.Х. и др, 2004; Хвойнов Д.В. и др., 2005; Sriskandan S. et al., 2006] и явлений воспалений аллергической и аутоиммунной природы [Медведев Ю.А. и др., 2000; Бакиева И.Г. и др., 2005; Алсынбаев М.М. и др., 2006].
В результате активации фагоцитов осуществляется целый ряд метаболических перестроек. Важнейшим механизмом, задействованным в процессах фагоцитоза является изменение активности кислород-зависимого метаболизма (КЗМ) и генерации свободных радикалов (СР) - активных форм кислорода (АФК) [Владимиров Ю.А., 2000; Фархутдинов Р.Р., 2006; Juergen A., 1999].
Интерес исследования данных процессов представлен в двух аспектах. С одной стороны важным является оценка динамики кислород-зависимых процессов и генерации АФК, поскольку они выступают в качестве одного из критериев, отражающих изменения функционально-метаболической реактивности фагоцитов под действием различных факторов, что позволит охарактеризовать влияние препаратов ВВИГ на фагоцитарные механизмы. С другой стороны актуальным является оценка действия препаратов на сами процессы образования свободных радикалов АФК. Свободно-радикальное окисление (СРО) - фундаментальный биологический процесс, обеспечивающий нормальную жизнедеятельность, а процессы фагоцитоза являются одним из путей образования свободных радикалов в организме. СР являются предметом многочисленных исследований, имеют большое значение в развитии воспаления [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Martins P.S. et al., 2003; Tripathi P. et al., 2007; Vajdovich P., 2008; Maor I. et al., 2008]. Так, АФК активируют белковый синтез, способствуют образованию хемоаттрактантов, образуют эффекторное звено аппарата биоцидности фагоцитов, направленной на деструкцию и элиминацию патогенных факторов [Маянский А.Н., 2005; Behe P. et al., 2007; Nauseff W.M., 2007]. Однако, кроме своего физиологического значения АФК в избыточном количестве могут инициировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызывать модификацию антигенов и повреждения молекул и клеток собственного организма, стать основой патогенеза многих заболеваний [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Martins P.S. et al., 2003; Gilca M. et al., 2007; Nguyen H.X. et al., 2007; Papatheodorou L. et al., 2007].
Известно, что многие ингибиторы свободно-радикальных реакций оказывают выраженное противовоспалительное действие. Поэтому интерес представляет оценка прямого влияния иммуноглобулиновых препаратов ВВИГ на процессы образования свободных радикалов, а также опосредованного - через взаимодействие с фагоцитарными клетками.
В настоящее время влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитные свойства фагоцитов и генерации ими АФК определяется только в процессе их лечебного применения in vivo [Алсынбаев М.М., 2002; Корженевский А.А. и др., 2002]. Сведения о лабораторных методах оценки активности ВВИГ до их клинического применения отсутствуют. В связи с этим, актуальна разработка экспресс-методов предварительной оценки влияния различных иммуноглобулиновых препаратов на функционально-метаболическую активность фагоцитов.
Перспективным способом оценки процессов кислород-зависимого метаболизма и генерации СР является регистрация сверхслабого свечения - хемилюминесценции (ХЛ), дающим возможность непрерывно наблюдать за динамикой образования радикалов [Владимиров Ю.А., 1999, 2007; Фархутдинов Р.Р. и др., 2005, 2006; Guzik T.J. et al., 2005]. Хемилюминесцентные методы позволяют судить о влиянии различных препаратов на процессы СРО. Так, в экспериментах in vitro можно по изменению интенсивности ХЛ при добавлении препаратов в модельные системы определить антиокислительную активность препаратов (АОА). Исследование спонтанной и стимулированной ХЛ фагоцитарных клеток все шире используется для изучения их функционального состояния и динамики образования АФК [Друх В.М., 2005; Заславская М.И. и др., 2006; Тевдорадзе С.И., 2006; Pavelkova M. et. al., 2004; Sinyakov M.S. et al., 2007].
С учетом вышеизложенного, изучение изменений функционально-метаболической активности фагоцитов и генерации ими СР под влиянием препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, а также определение антиокислительных свойств данных препаратов представляет научный и практический интерес.
Цель исследования
Оценить влияние препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функционально-метаболическую активность фагоцитов и генерацию свободных радикалов.
Задачи исследования
Определить воздействие разных препаратов иммуноглобулинов на генерацию свободных радикалов активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах.
Исследовать влияние препаратов внутривенных иммуноглобулинов на функционально-метаболическую активность и генерацию активных форм кислорода разными типами фагоцитов (интактные из крови и активированные из перитонеального воспалительного экссудата полиморфно-ядерные лейкоциты) при добавлении стимуляторов - объектов фагоцитоза in vitro и возможность оценки влияния препаратов по изменениям этой интенсивности с помощью регистрации хемилюминесценции.
Оценить in vitro изменения кислород-зависимого метаболизма интактных полиморфно-ядерных лейкоцитов из крови и перитонеальных макрофагов, и участвующих в динамике воспалительного процесса активированных перитонеальных полиморфно-ядерных лейкоцитов и мононуклеарных фагоцитов под влиянием разных доз препаратов внутривенных иммуноглобулинов.
Исследовать in vivo влияние препаратов на кислород-зависимые процессы фагоцитов (активированные полиморфно-ядерные лейкоциты - на фоне развития воспаления) при введении экспериментальным животным.
Научная новизна
Проведена оценка влияния препаратов ВВИГ на процессы свободно-радикального окисления: генерацию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах in vitro. Впервые показано, что все исследуемые ВВИГ угнетают ХЛ в модельных системах. ВВИГ способны подавлять образование свободных радикалов. Наиболее выраженное антиокислительное действие препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения проявляется в липидосодержащих модельных системах с высоким содержанием липидов низкой и очень низкой плотности.
Изучено воздействие препаратов ВВИГ на функционально - метаболическую активность фагоцитарных клеток разных видов и генерацию ими АФК при взаимодействии с различными стимуляторами - объектами фагоцитоза. Установлено, что препараты ВВИГ в низких концентрациях способны оказывать стимулирующее действие на функциональную активность фагоцитов, в неодинаковой степени выраженное для препаратов с разными технологиями производства по отношению к тем или иным объектам фагоцитоза.
Впервые установлено, что препараты ВВИГ в высоких концентрациях способны оказывать прямое ингибирующее действие на функционально-метаболическую активность полиморфно-ядерных и мононуклеарных фагоцитов - угнетать активацию процессов кислород-зависимого метаболизма этих клеток, генерацию ими АФК, выявляемую с помощью ХЛ.
Воздействие ВВИГ на инактные полиморфно-ядерные фагоциты крови и активированные полиморфно-ядерные лейкоциты из очага воспаления носит дозозависимый модулирующий разнонаправленный характер: низкие концентрации стимулируют генерацию АФК, высокие подавляют. Воздействие ВВИГ на интактные макрофаги и активированные мононуклеарные фагоциты крыс из очага воспаления характеризуются однонаправленными изменениями, осуществляется подавление генерации АФК.
Впервые проведено исследование влияния ВВИГ на процессы кислород-зависимого метаболизма фагоцитов и генерацию АФК (полиморфно-ядерные лейкоциты) in vivo. Установлено, что изменения активности кислород-зависимого метаболизма полиморфно-ядерных лейкоцитов крыс из очага воспаления после введения животным ВВИГ in vivo соответствуют таковым при воздействии препаратов на клетки in vitro и характеризуются дозозависимой разнонаправленностью: низкие концентрации ВВИГ стимулируют генерацию АФК клетками, а высокие - подавляют.
В результате проведенных исследований разработаны тест-системы, основанные на измерении хемилюминесценции, позволяющие оценивать влияние ВВИГ на функционально-метаболическую активность фагоцитирующих клеток и генерацию ими АФК.
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты исследования расширяют представление о влиянии ВВИГ на фагоцитарные механизмы иммунной защиты и процессы образования свободных радикалов - генерацию АФК и реакции ПОЛ.
Выявленные в работе свойства ВВИГ непосредственно взаимодействовать со СР и разнонаправлено изменять функционально-метаболическую активность фагоцитов и сопутствующую ей генерацию АФК являются одними из механизмов модулирующего и противовоспалительного действия препаратов. Результаты, полученные с помощью регистрации хемлюминесценции дают возможность рекомендовать разработанные в работе методы для определения биологических свойств препаратов ВВИГ и доклинической сравнительной оценки их эффективности in vitro. По материалам диссертации получены два патента на изобретение: “Способ определения стимулирующего действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на защитную активность фагоцитов” № 2318 202, Бюл. № 6, 2008 и “Способ определения противовоспалительного действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения” № 2331 885, Бюл. № 23, 2008.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность лаборатории препаратов крови филиала Иммунопрепарат ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа и Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на лекциях и занятиях на кафедре морфологии и физиологии человека и животных биологического факультета Башкирского государственного университета и кафедре нормальной физиологии Башкирского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту
Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения в модельных системах подавляют процессы перекисного окисления липидов и генерации активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хемилюминесценции.
Препараты внутривенных иммуноглобулинов оказывают стимулирующее действие на показатели функционально - метаболической активности (поглотительная способность, кислород-зависимый метаболизм) интактных полиморфно-ядерных лейкоцитов крови и активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов воспалительного экссудата по отношению к разным объектам фагоцитоза и на интенсивность генерации ими активных форм кислорода, определяемых с помощью регистрации хемилюминесценции, в которой четко отражается степень выраженности такого влияния.