2. ОБСУЖДЕНИЕ
При РА фибробластоподобные синовиальные клетки активно пролиферируют, образуя агрессивную грануляционную ткань - паннус, которая в процессе роста разрушает кость, хрящ, связки, что приводит к деструкции и деформации сустава. Важно отметить, что паннус, сохраняющийся у больных в течение всего времени болезни, формируется после «иммунной» фазы развития РА, продолжающейся около года [4]. В разрушении внеклеточного матрикса хряща участвуют различные ферменты, секретируемые в первую очередь ФСК паннуса: коллагеназы, желатиназы, аггреканазы, стромелизин; сериновые протеазы (трипсин, химотрипсин), катепсины, металлопротеиназы (MMP) [19].
Помимо деструкции хряща происходит разрушение костной ткани с участием остеокластов, которые накапливаются в субхондральном костном мозге и в зоне контакта паннуса и кости [20-22]. Резорбция кости осуществляется путем взаимодействия рецептора активатора NFkB (RANK) на мембране остеокластов [5], с лигандом RANKL [6], который относится к семейству факторов некроза опухоли и представлен на поверхности остеобластов, стромальных клеток костного мозга, ФСК. Он также секретируется активированными Т-клетками при стимуляции провоспалительными цитокинами (TNF, IL-1, IL-17) [1, 3]. Антагонистом субсистемы RANK - RANKL является растворимый рецептор - остеопротегерин [23] - гликопротеин, относящийся к семейству фактора некроза опухоли [7]. Он ингибирует связывание RANK и RANKL, тем самым угнетая мобилизацию, пролиферацию и активацию остеокластов. У взрослых людей остеопротегерин выделяется остеобластами после их активации [24], также обнаруживается в эндотелиальных клетках и макрофагах синовиальной ткани и субсиновиальном слое [8, 25].
Показано, что провоспалительные цитокины IL-1P, IL-6 совместно с растворимыми рецепторами sIL-6R, IL-17 и TNFa стимулируют продукцию остеопротегерина ФСК больных RA до уровня 520 нг/мл, достаточного для ингибирования остеокластогенеза in vitro [26]. Эти провоспалительные цитокины повышают продукцию ОПГ прямо или косвенно путем стимуляции синтеза простагландина E2 (PGE2) [26]. В противоположность действию указанных цитокинов основной фактор роста фибробластов bFGF ингибирует продукцию ОПГ ФСК за счет подавления прямого стимулирующего действия провоспалительных цитокинов [26]. Результаты наших исследований подтверждают данные литературы о том, что провоспалительный цитокин IL-1P усиливает синтез ОПГ ФСК. Помимо этого, нами показано, что в сложной цепи регуляции продукции ОПГ ФСК важная роль принадлежит процессам метилирования и деметилирования ДНК, в частности, донаторы метильных групп способствуют снижению синтеза ОПГ ФСК in vitro.
Уместно заметить, что, по данным M. Skoumal и соавт., содержание ОПГ значительно снижено в синовиальной жидкости больных РА, в результате чего увеличивается содержание RANKL [11]. По мнению авторов исследования, уменьшение концентрации ОПГ в синовиальной жидкости отражает низкий защитный эффект ОПГ на кость, что способствует более раннему и более выраженному разрушению кости у больных РА. Таким образом, регуляция продукции ОПГ различными клетками, в том числе ФСК, происходит с участием большого числа стимулирующих и ингибирующих факторов, механизмы координации действия которых нам еще предстоит уточнить. Несомненно, что среди этих факторов важная роль принадлежит регуляторам процесса метилирования ДНК.
ФСК способны к миграции в различные, в том числе интактные суставы, лежащей в основе полиартикулярного поражения при РА [3]. Кроме этого, синовиальные фибробласты больных РА характеризуются инвазивным ростом, сохраняющимся после ряда пассажей в культуре [2]. Предполагается, что в основе формирования стабильно активированного деструктивного, апоптозустойчивого фенотипа ФСК при РА, способного к миграции и инвазии, лежат эпигенетические изменения, включая изменения в метилировании ДНК [27]. Эпигенетические нарушения ФСК больных РА влекут за собой внутриклеточные метаболические изменения, касающиеся содержания глюкозы, липидов, кислорода, ферментов, цитокинов и др. [28], обеспечивая высокий провоспалительный потенциал клеток [13].
Анализ миграции и инвазии различных типов клеток in vitro первоначально осуществлялся в предложенных Бойденом камерах, состоящих из двух отсеков [29]. В последующем были разработаны улучшенные и упрощенные одноразовые варианты оригинальных камер, однако основной принцип метода сохранен во всех модификациях, описанных в подробном обзоре N. Kramer и соавт. [29].
Обязательным является наличие двух отсеков камеры, содержащих питательную среду и разделенных пористой мембраной, через которую клетки перемещаются. Миграция определяется как направленное перемещение клеток на субстрате, таких как базальные мембраны, волокна внеклеточного матрикса или пластиковая поверхность планшета [29]. При этом разные типы клеток могут использовать различные варианты моторики, которые обязательно включают прочную фокальную фиксацию к внеклеточному матриксу, цитоскелетное сокращение и удлинение веретеноподобных клеточных тел.
Инвазия определяется как движение клеток с помощью ЗЭ-матрицы, которое сопровождается реструктуризацией ЗО-среды. Для того чтобы путешествовать через матрицу, клетка должна изменить свою форму и взаимодействовать с внеклеточным матриксом, который, с одной стороны, дает возможность клеткам прикрепиться к субстрату, с другой стороны, представляет собой барьер для движущихся клеток. Процесс инвазии многокомпонентен. Он включает в себя адгезию, протеолиз внеклеточных компонентов матрикса и собственно миграцию [12, 29]. Основным отличием анализа миграции от анализа инвазии в камере Бойдена является то, что пористую мембрану между верхней и нижней камерой покрывают тонким слоем внеклеточного матрикса, перед тем как клеточную взвесь добавляют в верхнюю камеру. Внеклеточный матрикс может быть разным, в наших экспериментах использовалась водорастворимая пленка коллагена I. Внеклеточный матрикс закупоривает поры мембраны, блокируя тем самым миграцию неинвазивных клеток.
Следует отметить, что современные способы стандартизации и автоматизации методов миграции и инвазии различных клеток, в том числе опухолевых, позволили использовать их для эффективного доклинического скоростного скрининга большого числа потенциальных лекарственных средств, имеющих разные мишени [12]. Ограничением метода является отсутствие соответствия между результатами доклинических и клинических исследований. Показано, например, что металлопротеиназы способствуют инвазии опухолевых клеток через окружающие ткани in vitro, а применение ингибиторов металлопротеиназ у больных не снижает риска метастазирования [12].
В исследовании M.A. Shelef и соавт. установлено, что ингибиторы фокальной адгезионной киназы (FAK) уменьшают миграцию и инвазию ФСК in vitro, но не снижают тяжесть экспериментального артрита у мышей [30]. Эти данные свидетельствуют о том, что в многокомпонентной цепи механизмов миграции и инвазии клеток одно эффективное селективное вмешательство в эти процессы in vitro не гарантирует развития клинического эффекта.
В наших исследованиях показано, что модуляция глобального метилирования и деметилирования ДНК в ФСК больных РА с помощью известных фармакологических соединений приводит к одинаковому результату: снижению миграции и инвазии в случае применения донаторов метильных групп и деметиляторов. Это можно объяснить сложностью этапов миграции и инвазии, каждый из которых контролируется различными факторами, включая гипометилирование и гиперметилирование промоторных участков генов ДНК, ответственных за экспрессию белков, участвующих в миграции и инвазии. Следует также помнить, что регуляцию экспрессии генов в промоторных участках ДНК ФСК осуществляют не только механизмы метилирования ДНК, но и ацетилирования гистонов, малые некодирующие РНК и другие факторы эпигенома [27]. Пока неясно, как координируются процессы нарушения метилирования ДНК, ацетилирования гистонов, активности малых РНК, обеспечивая стабильность фенотипа ФСК, их провоспалительный потенциал, хотя эпигенетические изменения уже могут объяснить некоторые ключевые особенности измененного фенотипа ФСК при РА. Важно то, что большинство приобретенных эпигенетических нарушений - обратимые процессы, регулируемые специфическими ферментами и кофакторами, которые позволяют клеткам изменять экспрессию генов в ответ на различные раздражители. И это значит, что ферменты и молекулярные комплексы, участвующие в этих процессах, являются потенциальными терапевтическими мишенями, а культура ФСК больных РА in vitro - адекватная модель для доклинического скрининга новых лекарственных соединений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования показано, что культуры ФСК больных РА при стимуляции IL-1P увеличивают продукцию остеопротегерина. Внесение в культуры метилирующих соединений - SAMe и генистеина - приводило к статистически значимому снижению продукции ОПГ, а добавление деметилирующего агента гидралазина не меняло синтез цитокина. Все три используемых модулятора метилирования ДНК в разных концентрациях статистически значимо снижали количество спонтанно мигрировавших и инвазивных ФСК в камере Бойдена. Таким образом, ферменты и молекулярные комплексы, участвующие в процессах метилирования ДНК, являются потенциальными терапевтическими мишенями, а культура ФСК больных РА in vitro может быть моделью для доклинического скрининга новых лекарственных соединений.
ревматоидный артрит дезоксирибонуклеиновый метилирование
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Huber L.C., Distler O., Tarner I., Gay R.E., Gay S., Pap T. Synovial fibroblasts: key players in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 2006; 45 (6): 669-675.
2. Mьller-Ladner U., Kriegsmann J., Franklin B.N., Mat- sumoto S., Geiler T., Gay R.E., Gay S. Synovial fibroblasts of patients with rheumatoid arthritis attach to and invade normal human cartilage when engrafted into SCID mice. Am. J. Pathol. 1996; 149 (5): 1607-1615.
3. Lefиvre S., Knedla A., Tennie C., Kampmann A., Wun- rau C., Dinser R., Korb A., Schnдker E.M., Tarner I.H., Robbins P.D., Evans C.H, Stьrz H., Steinmeyer J., Gay S., Schцlmerich J., Pap T., Mьller-Ladner U., Neumann E. Synovial fibroblasts spread rheumatoid arthritis to unaffected joints. Nat. Med. 2009; 15 (12): 1414-1420.
4. Шнайдер М.А., Ширинский В.С., Ширинский И.В. Культура фибробластоподобных синовиальных клеток больных ревматоидным артритом: свойства и возможности. Медицинская иммунология. 2016; 18 (2): 107-118. [Schneider M.A., Shirinsky V.S., Shirinsky I.V. Cultures of fibroblast-like synovial cells from patients with rheumatoid arthritis: properties and opportunities. Medical Immunology. 2016; 18 (2): 107-118 (in Russ.)].
5. Boyle W.J., Simonet W.S., Lacey D.L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003; 423: 337-342.
6. Takayanagi H., Oda H., Yamamoto S., Kawaguchi H., Tanaka S., Nishikawa T., Koshihara Y. A new mechanism of bone destruction in rheumatoid arthritis: synovial fibroblasts induce osteoclastogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 240 (2): 279-286.
7. Lacey D.L., Timms E., Tan H.-L., Kelley M.J., Dunstan C.R., Burgess T., Elliot R., Colombero A., Elliot G., Scully S., Hsu H., Sullivan J., Hawkins N., Davy E., Capparelli C., Eli A., Qian Y.X., Kaufman S., Sarosi I., Shalhoub V.,
Senaldi G., Guo J., Delaney J., Boyle W.J. Osteoprote- gerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 1998; 93: 165-176.
8. Haynes D.R., Barg E., Crotti T.N., Holding C., Weedon H., Atkins G.J., Zannetino A., Ahern M.J., Coleman M., Roberts-Thomson P.J., Kraan M., Tak P.P., Smith M.D. Os- teoprotegerin expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathies and osteoarthritis and normal controls. Rheumatology (Oxford), 2003. 42 (1): 123-134.
9. Crotti T.N., Ahern M.J., Lange K., Weedon H., Coleman M., Roberts-Thomson P.J., Haynes D.R., Smith M.D. Variability of RANKL and osteoprotegerin staining in synovial tissue from patients with active rheumatoid arthritis: quantification using color video image analysis. J. Rheumatol. 2003; 30 (11): 2319-2324.
10. Fonseca J.E., Cortez-Dias N., Francisco A., Sobral M., Canhao H., Resende C., Castelro W., Macieira C., Se- queira G., Saraiva F., Pereira da Silva J.A., Carmo-Fon- seca M., Viana Queiroz M. Inflammatory cell infiltrate and RANKL/ OPG expression in rheumatoid synovium: comparison with other inflamatory arthropathies and correlation with outcome. Clin. Exp. Rheumatol. 2005; 23 (2): 185-192.
11. Skoumal M., Kolarz G., Haberhauer G., Woloszczuk W., Hawa G., Klingler A. Osteoprotegerin and the receptor activator of NF-kappa B ligand in the serum and synovial fluid. A comparison of patients with longstanding rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Rheumatol. Int. 2005; 26 (1): 63-69.
12. Moutasim K.A., Nystrom M.L., Thomas G.J. Cell migration and invasion assays. Methods in Molecular Biology. 2011; 731: 333-343.
13. Bartok B., Firestein G.S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 2010; 233 (1): 233-255.
14. Portela A., Esteller M. Epigenetic modifications and human diseases. Nat. Biotechnol. 2010; 28 (10): 1057-1068.
15. Dolinoy D.C., Weidman J.R., Waterland R.A., Jirtle R.L. Maternal genistein alters coat color and protects avy mouse offspring from obesity by modifying the fetal epigenome. Environ. Health Perspect. 2006; 114 (4): 567-572.
16. Li J., Gang D., Yu X., Hu Y., Yue Y., Cheng W., Pan X., Zhang P. Genistein: the potential for efficacy in rheumatoid arthritis. Clin. Rheumatol. 2013; 32 (5): 535-540.
17. Arce C., Segura-Pacheco B., Perez-Cardenas E., Taja- Chayeb L., Candelaria M., Duennas-Gonzalez A. Hydralazine target: from blood vessels to the epigenome. J. Transl. Med. 2006; 4: 10-22.
18. Lydersen S. Statistical review: frequently given comments. Ann. Rheum. Dis. 2015; 74 (2): 323-325.
19. Firestein G.S. Etiology and pathogenesis of rheumatoid arthritis. In: Firestein G.S., Budd R.C., Harris T., McInnes I.B., Ruddy S., Sergent J.S., editors. Kelly's Textbook of Rheumatology. Philadelphia, PA: Saunders Elsevier, 2009: 1035-1086. DOI: 10.1016/B978-0-323- 31696-5.00069-3.
20. RedlichK., HayerS., RicciR., DavidJ.P., Tohidast-Akrad M., Kollias G., Steiner G., Smolen J.S., Wagner E.F., Schett G. Osteoclasts are essential for TNF-a-mediated joint destruction. J. Clin. Invest. 2002; 110 (10): 1419-1427.
21. Bromley M., Woolley D.E. Chondrocytes and osteoclasts at subchondral sites of erosions in the rheumatoid joint. Arthitis Rheum. 1984; 27 (9): 968-975.
22. Gravallese E.M., Manning C., Tsay A., Naito A., Pan C., Amento E., Goldring S.R. Synovial tissue in rheumatoid arthritis is a source of osteoclast differentiation factor. Arthritis Rheum. 2000; 43: 250-258.
23. Yasuda H., Shima N., Nakagawa N., Yamaguchi K., Kino- saki M., Mochizuki S.-I., Tomoyasu A., Yano K., Goto M., Murakami A., Tsuda E., Morinaga T., Higashio K., Udagawa N., Takahashi N., Suda T. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogene- sis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998; 95 (7): 3597-3602.
24. Simonet W.S., Lacey D.L., Dunstan C.R., Kelley M., Chang M.S., Lьthy R., Nguyen H.Q., Wooden S., Bennett L., Boone T., Shimamoto G., DeRose M., Elliott R., Co- lombero A., Tan H.L., Trail G., Sullivan J., Davy E., Bu- cay N., Renshaw-Gegg L., Hughes T.M., Hill D., Pattison W., Campbell P., Sander S., Van G., Tarpley J., Derby P., Lee R., Boyle W.J. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell. 1997; 89: 309-319.
25. Hofbauer L.C., Khosla S., Dunstan C.R., Lacey D.L., Boyle W.J., Riggs B.L. The roles of osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand in the paracrine regulation of bone resorption. J. Bone Miner. Res. 2000; 15: 2-12.
26. Yano K., Nakagawa N., Yasuda H., Tsuda E., Higa- shio K. Synovial cells from a patient with rheumatoid arthritis produce osteoclastogenesis inhibitory factor/ osteoprotegerin: reciprocal regulation of the production by inflammatory cytokines and basic fibroblast growth factor. J. Bone Miner. Metab. 2001; 19 (6): 365-372.
27. Klein K., Ospelt C., Gay S. Epigenetic contributions in the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Res. Ther. 2012; 14 (6): 227.
28. Bustamante M.F., Garcia-Carbonell R., Whisenant K.D., Guma M. Fibroblast-like synoviocyte metabolism in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthritis. Res. Ther. 2017; 19 (1): 110.
29. Kramer N., Walzl A., Unger C., Rosner M., Krupitza G., Hengstschlдger M., Dolznig H. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res. 2013; 752 (1): 10-24.
30. Shelef M.A., Bennin D.A., Yasmin N., Warner T.F., Ludwig T., Beggs H.E., Huttenlocher A. Focal adhesion kinase is required for synovial fibroblast invasion, but not murine inflammatory arthritis. Arthritis Res. Ther. 2014; 16 (5): 464.