Статья: Влияние модуляторов метилирования ДНК на продукцию остеопротегерина ревматоидными фибробластоподобными синовиоцитами in vitro, их миграцию и инвазию

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии (НИИФКИ) Россия, 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

Влияние модуляторов метилирования ДНК на продукцию остеопротегерина ревматоидными фибробластоподобными синовиоцитами in vitro, их миграцию и инвазию

Шнайдер М.А., Ширинский В.С., Калиновская Н.Ю., Ширинский И.В.

РЕЗЮМЕ

Цель. Изучить влияние модуляторов метилирования ДНК на продукцию провоспалительных цитокинов фибробластоподобными синовиальными клетками (ФСК).

Материалы и методы. Использовались клетки, полученные из синовиальной ткани шести больных активным ревматоидным артритом (РА) после 3-7 пассажей культивирования in vitro.

Результаты. Установлено, что культуры ФСК больных РА при стимуляции IL-1P увеличивают продукцию остеопротегерина (ОПГ). Внесение в культуры метилирующих соединений - S-аденозилметионина ^АМе) и генистеина - приводило к статистически значимому снижению продукции ОПГ, а добавление деметилирующего агента гидралазина не меняло синтез цитокина. Все три используемых модулятора метилирования ДНК в разных концентрациях статистически значимо снижали количество спонтанно мигрировавших и инвазивных ФСК в камере Бойдена.

Заключение. Ферменты и молекулярные комплексы, участвующие в процессах метилирования ДНК, являются потенциальными терапевтическими мишенями, а культура ФСК больных РА in vitro может быть моделью для доклинического скрининга новых лекарственных соединений.

Ключевые слова: фибробластоподобные синовиальные клетки, S-аденозилметионин, генистеин, гидралазин, остеопротегерин, инвазия, миграция.

ABSTRACT

Effect of DNA methylation modulators on the production of osteoprotegerin by rheumatoid fibroblast-like synoviocytes in vitro: their migration and invasion

Shnayder M.A., Shirinsky V.S., Kalinovskaya N.Y., Shirinsky I.V.

Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology 14, Yadrintsevskaya Str, Novosibirsk, 630099, Russian Federation

Objective. The purpose of the research was to study the effect of DNA methylation modulators on the production of proinflammatory cytokines by fibroblast-like synovial cells (FLC).

Materials and methods. We used the cells derived from the synovial tissue of 6 patients with active rheumatoid arthritis (RA) after 3-7 in vitro culturing passages.

Results. There was an IL-1p-induced up-regulation of osteoprotegerin (OPG) synthesis in the RA FLC cultures. The addition of methylating compounds S-Adenosyl methionine (SAMe) and genistein into the cultures resulted in a statistically significant decrease in the production of OPG, while the addition of the demethylating agent hydralazine did not change the synthesis of the cytokine. All three DNA methylation modulators used at different concentrations significantly reduced the percentage of spontaneous migration and invasion of FLC in the Boyden chamber.

Conclusion. Enzymes and molecular complexes involved in DNA methylation could be potential therapeutic targets, and in vitro FLC cultures of RA patients can be used as a model for preclinical screening of new drug compounds.

Key words: fibroblast-like synovial cells, S-Adenosyl methionine, genistein, hydralazine, osteoprotegerin, invasion, migration

ВВЕДЕНИЕ

Фибробластоподобные синовиальные клетки (ФСК) являются доминирующей популяцией клеток в гиперплазированном синовии больных ревматоидным артритом (РА) и в месте инвазии синовиальной оболочки (СО) в хрящевую и костную ткань. ФСК представляют собой уникальный тип клеток, который отличает РА от других воспалительных заболеваний суставов и СО здоровых людей [1], и характеризуются относительной автономностью функционирования и способностью к инвазивному росту, сохраняющемуся после ряда пассажей в культуре т пг1;го [2], и миграции в различные, в том числе интактные суставы, лежащей в основе полиартикулярного поражения при РА [3].

Активированные цитокинами ФСК являются главным источником провоспалительных медиаторов, металлопротеиназ, других биологически активных веществ, принимая участие в деструкции хрящевой и костной ткани, миграции и пролиферации в СО антигенпрезентирующих клеток, субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, нейтрофилов,

NK-клеток, ангиогенезе [4]. Резорбция кости осуществляется в субсистеме клеточных лиганд - активатор NFkB (RANK), экспрессирующийся остеокластами [5], а роль лиганда - RANKL [6]. Антагонистом субсистемы RANK - RANKL является растворимый рецептор остеопротегерин (ОПГ) [7]. ОПГ представляет собой гликопротеин, относящийся к семейству факторов некроза опухоли, и выполняет роль «ловушки» рецепторов, ингибируя связывание RANK и RANKL, тем самым угнетая мобилизацию, пролиферацию и активацию остеокластов. Полагают, что характер ремоделирования костной ткани (анаболизм и катаболизм) во многом определяется балансом между продукцией RANKL и ОПГ [8-11].

Использование ФСК вне организма, в условиях культивирования in vitro, - продолжение метода биопсии, который существенно расширяет возможности изучения патогенеза РА [4] и является моделью для доклинического скрининга новых лекарственных средств [12].

Показано, что ФСК больных РА характеризуются стабильным, возникающим in vivo и сохраняющимся после неоднократных пассажей in vitro фенотипом, обусловленным глобальным гипометилированием ДНК, сопоставимым по выраженности с гипометилированием ДНК в опухолевых клетках [13]. Известны ряд соединений растительного и синтетического происхождения, которые in vitro способны изменять глобальное метилирование ДНК. К их числу относятся донаторы метильной группы S-аденозилметионин (SAM^) [14] и изофлавоноид сои генистеин [15, 16], деметилирующий агент гидралазин [17].

Цель исследования - оценить влияние метилирующих (S-аденозилметионина, генистеина) и гипометилирующих (гидралазина) агентов на продукцию остеопротегерина фибробастоподоб- ными синовиальными клетками больных РА in vitro, их миграцию и инвазию.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ревматоидные ФСК выделялись из синовиальной ткани, полученной во время операции эндопротезирования коленного сустава от девяти больных активным РА, материалы были предоставлены сотрудниками ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России.

Поскольку для исследования использовались анонимные ткани, предназначенные для утилизации, одобрения этического комитета и предоставление информированного согласия не требовалось.

Последовательные этапы культивирования описаны нами ранее [4], здесь мы ограничимся лишь основными сведениями. Ткань, полученную из синовиальной оболочки коленного сустава больных РА во время операции, помещали в контейнер при температуре 4 °С. Затем ткань промывали холодным фосфатным буфером и помещали в 150-миллиметровую чашку Петри для удаления нежелательных тканей (жир и др.). Перемещали ткань в чистую 150-миллиметровую чашку Петри и нарезали кусочками, образцы ткани переносили в колбу, содержащей 1%-й раствор трипсина и фосфатного буфера. Инкубировали при 37 °С в течение 30 мин, после инкубации удаляли супернатант. К оставшейся в колбе ткани добавляли раствор коллагеназы Р (Sigma-Aldrich, США) со средой DMEM (Биолот), содержащей фетальную бычью сыворотку FBS (Hyclone), и продолжали инкубацию в течении 2 ч при 37 °С и 5% СО2. Пипетировали смесь через клеточный фильтр в пробирку объемом 50 мл, клеточную взвесь центрифугировали при 250 g 10 мин. Затем удаляли супернатант, взвесь клеток размешивали, промывали добавлением 15 мл DMEM и вновь центрифугировали. Количество жизнеспособных клеток подсчитывали с помощью трипанового синего. Взвесь ресус- пендировали в среднем 1 х 106 клеток в 15 мл DMEM, клетки вносили в Т-75 флакон, содержащий 5 мл DMEM, 10% FBS (Hyclone), 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицина, 2 ммоль L-глутамина и 2,5 мкг/мл амфотерицина В, инкубировали флакон при температуре 37 °С и 5% СО2.

Для исследования применялись ФСК, культивированные между 3-7 пассажами. Клетки в концентрации 5 х 105 кл/мл культивировали 48 ч в 24-луночных планшетах. ФСК стимулировали IL-1P 10 нг/мл (R&D Systems) в течение 1 ч при температуре 37 °С и 5% СО2, затем к культурам добавляли один из модуляторов метилирования ДНК: SAMe (Abbot, США) в концентрации 25, 50, 100 мкг/мл, генистеин (LC Laboratories, США) в концентрации 5, 10, 20 мкг/мл или гидрала- зин (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 5, 10, 20 мкмоль/мл. После 48 ч инкубации определяли уровень остеопротегерина в супернатантах клеточных культур с помощью набора Osteoprotegerin Human ELISA Kit (Abcam), согласно инструкции фирмы производителя.

Для исследования клеточной миграции и инвазии ФСК использовали модифицированные камеры Бойдена, состоящие из двух отсеков, разделенных 8-микрометровой пористой мембраной (Transwell 96, фирма Trevigen, Gaithersburg, США). Основные этапы оценки миграции ФСК следующие. За 24 ч до начала эксперимента ФСК 3-7 пассажей находились в бессывороточной питательной среде DMEM. После «сывороточного голодания» клетки трипсинизировали, считали и вновь ресуспендировали до 1 х 106 кл/ мл. В каждую лунку верхней камеры добавляли 5 х 104 клеток (50 мкл клеточной взвеси), в нижние камеры, в качестве хемоаттрактанта, вносили 150 мкл питательной среды с 10% FBS и модуляторы метилирования ДНК: SAМе (Abbot) 25, 100 мкг/мл; генистеин (LC Laboratories) 5, 20 мкг/мл или гидралазин (Sigma-Aldrich) 5, 20 мкмоль/мл. Планшет инкубировали при 37 °С и 5% CO2 в течение 48 ч, затем ФСК верхней и нижней камеры аспирировали и промывали промывочным фосфатным буфером. К нижней камере добавляли Cell Dissociation/ Calcein-AM (способствует флуоресценции клеток за счет образования свободного кальцеина) и инкубировали при 37 °С и 5% CO2 в течение 1 ч. Оценку уровня миграции проводили на флуоресцентном ридере (Multiskan Ascent, Thermo Electron). Количество мигрировавших клеток выражалось в процентах от общего числа клеток, вносимых в верхний отсек камеры Бойдена.

Для оценки уровня инвазии разделительную пористую мембрану предварительно покрывали раствором коллагена I, который вносили в верхний отсек камеры и инкубировали планшет в течение 8 ч при 37 °С и 5% CO2. Дальнейшие манипуляции проводили аналогично этапам при оценке миграции ФСК. Количество инвазивных клеток также выражалось в процентах от общего числа клеток, вносимых в верхний отсек камеры Бойдена.

Статистический анализ. Большинство изучаемых параметров имело ненормальное распределение. Тем не менее мы использовали среднее и ошибку среднего для описательной статистики и парный t-тест для оценки различий между группами, так как эти методы являются робастными к отклонениям от нормальности, и их применение предпочтительно даже в случае ненормального распределения [18].

2. РЕЗУЛЬТАТЫ

Таблиця 1 Влияние модуляторов метилирования ДНК на миграцию и инвазию фибробластоподобных синовиальных клеток больных РА in vitro, M ± m Effect of DNA methylation modulators on the migration and invasion of fibroblast-like synovial cells of RA patients in vitro, M ± m

Примечание. Представлен средний процент (ошибка средней) клеток, осуществивших миграцию/инвазию. Абсолютное значение величины, принятой за 100% -- 5 х 104 (количество клеток, внесенных в лунку).

Note. The average percentage (average error) of the cells that carried out the migration/invasion are presented. The absolute value of the value taken as 100% is 5 х 104 (the number of cells introduced into the well).

На рисунке представлены данные о влиянии модуляторов метилирования ДНК в разных концентрациях на IL-1P стимулированную продукцию остеопротегерина фибробластоподобными синовиальными клетками. Видно, что внесение в культуры ФСК IL-1P увеличивает продукцию ОПГ более чем в 1,5 раза. Добавление в культуры донатора метильных групп SAMe в дозах 25 и 100 мкг/мл статистически значимо снижало стимулированный синтез ОПГ. Сходным эффектом обладал другой донатор метильных групп генистеин в дозах 5 и 20 мкг/мл. Добавление к клеткам различных доз деметилирующего агента гидралазина не изменяло уровень ОПГ в супернатантах культур ФСК.

Рисунок 1 Влияние модуляторов метилирования ДНК в разных концентрациях на IL-ip стимулированную продукцию остеопротегерина фибробластоподобными синовиальными клетками больных ревматоидным артритом, пг/мл * p < 0,05 между спонтанной и IL- ip стимулированной продукцией ОПГ; * p < 0,05 между IL- ip стимулированной продукцией и продукцией после добавления модуляторов. Figure 1 The effect of DNA mйthylation modulators in different concentrations on IL-ip stimulated production of osteoprotegerin by fibroblast-like synovial cells of patients with rheumatoid arthritis, pg/ml *f p < 0.05 between spontaneous and IL-ip stimulated production of OPG; * p < 0.05 between IL-ip stimulated production and production after the addition of modulators

В таблице представлены данные о влиянии модуляторов метилирования ДНК на способность ФСК к миграции и инвазии в камере Бойдена.

Установлено, что миграционной способностью обладали в среднем 45% ФСК, внесенных в камеры Бойдена для культур клеток, способностью к инвазии через матрицу коллагена i-го типа - 38% клеток.

Видно, что БАМе, гидралазин, генистеин статистически значимо уменьшали показатель инвазии, в среднем на 55%, а показатель миграции - на 15%. Дозозависимого эффекта не отмечено.

Таким образом, культуры ФСК больных РА 3-7 пассажей при стимуляции 1Ь-1Р увеличивают продукцию ОПГ. Внесение в культуры метилирующих соединений - БАМе и генистеина - приводило к статистически значимому снижению продукции ОПГ, а добавление деметилирующего агента гидралазина не меняло синтез цитокина. Все три используемых модулятора метилирования ДНК в разных концентрациях статистически значимо снижали процент спонтанно мигрировавших и инвазивных ФСК в камере Бойдена.