Материал: Влияние антропогенного загрязнения на фитохимический состав листьев подорожника большого

Одновременно проводили холостой анализ, включая все его стадии, кроме взятия проб почвы. В полученном фильтрате определяли элементы атомно-абсорбционным методом в пламени ацетилен - воздух.

.5 Атомно-абсорбционная спектрометрия

Атомно-абсорбционная спектрометрия - это метод анализа, основанный на способности атомов определяемых элементов селективно поглощать резонансное излучение определенной для каждого элемента длины волны.

Качественный анализ вещества или определение элементного состава осуществляли по появлению в спектре характеристических линий поглощения атомов. Количественный анализ основан на зависимости одного из параметров, характеризующих линию поглощения, от концентрации атомов элемента в поглощающем слое.

Этот метод выгодно отличается от традиционных аналитических методов универсальностью, простотой выполнения анализа и высокой производительностью и обеспечивает высокий предел обнаружения, что позволяет в частности использовать его для определения микроэлементов в растениях.

.5.1 Общая схема аналитического процесса при атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС)

Атомно-абсорбционный метод анализа наиболее разработан для определения элементного состава жидких проб, поэтому аналитический процесс метода проводят по установленной схеме.

Отбирали определенную массу анализируемого вещества для химической обработки этой навески с целью разрушения структуры вещества, растворения составляющих элементов и приготовление рабочего раствора. Создавали поглощающий слой атомного пара. С этой целью рабочий раствор пробы вводили в атомизатор, в котором растворитель испаряется, сухой остаток разлагается и превращается в атомный пар. Через слой атомного пара пропускали свет от источника излучающего характеристический линейчатый спектр определяемого элемента. Из светового потока, прошедшего через поглощающий слой, выделяли участок спектра соответствующий резонансной линии поглощения.

Оценивали сначала величину поглощенной энергии и затем - аналитического сигнала. Строили градуировачный график по результатам замера аналитического сигнала для стандартных растворов и определяли расчетный коэффициент для интервала концентрации, в котором градуировачный график прямолинеен. Вычисляли концентрацию определяемого элемента.

Оценивали правильность результатов анализа партии проб путем сравнения результатов анализа стандартных проб путем сравнения результатов анализа стандартных образцов состава (СОС) с данными их аттестации.

2.6 Количественное определение полисахаридов

Государственная фармакопея (1989) предлагает проводить стандартизацию листьев Подорожника большого по суммарному содержанию полисахаридов в водном извлечении гравиметрией.

Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 10 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляли 200 мл воды, колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили при перемешивании на электрической плитке в течение 30 мин. Экстракцию повторяли еще 2 раза, используя первый раз 200 мл, второй раз- 100 мл воды. Водные извлечения объединяли.

мл раствора помещали в пробирку, прибавляли 75 мл 95% спирта, перемешивали, подогревали на водяной бане до 30^оС в течение 5 мин. Осадок фильтровали и последовательно промывали 15 мл 95% спирта этилового. Фильтр с осадком высушивали сначала на воздухе, затем при температуре 100- 10^оС до постоянной массы.

Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в % (Х) вычисляли по формуле:

где m₁ - это масса фильтра в г;

m₂ - масса фильтра с осадком в г;

W - потеря в массе при высушивании сырья в %;

m - масса сырья в г.

2.7 Метод определения содержания суммы хлорофиллов

Аналитическую пробу воздушно-сухого сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г сырья (точная навеска) помещали в колбу на 100 мл, заливали 30 мл спирта этилового 90% и настаивали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, затем настаивали в течение 30 минут при встряхивании в шейкере, предварительно плотно закрыв колбы. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр, фильтр помещали обратно в колбу. Экстракцию повторяли дважды, используя каждый раз по 20 мл экстрагента. Полученные фильтраты объединяли, замеряли объём полученного извлечения и проводили измерение оптической плотности на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 666 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 90%.

Расчёт количественного содержания суммы хлорофиллов производили с помощью калибровочного графика, построенного по РСО хлорофилла-α по формуле:

где D - показатель оптической плотности;

V - объём извлечения;

K - коэффициент пересчёта, рассчитанный по калибровочному графику, построенному по РСО хлорофилла-α;

 m - точная навеска сырья, г;

W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах (Губин К.В., Ханина М.А., 2009).

2.8 Статистический анализ результатов исследования

Статистическая обработка данных осуществлялась по общепринятым методикам на в среде Windows с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. и Microsoft Excel версии 2000. При работе с базой данных проводилось определение средних арифметических значений (M), стандартных ошибок средних арифметических (m), стандартного отклонения, оценки значимости различий средних арифметических по критерию t Стьюдента. Для оценки степени связи между изучаемыми количественными признаками определялся коэффициент корреляции (r) (Митропольский А.К., 1971).

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

.1 Зольность листьев П. большого в зависимости от места сбора

Под общей золой понимают прокаленный минеральный остаток, полученный в результате сжигания пробы испытуемого вещества.

Нами была рассчитана зависимость между количеством золы общей в листьях растения и расстоянием от оси дороги и достоверность разности между зольностью для вымытых и немытых растений. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 Количество золы общей на разном удалении от автотрассы

Согласно полученным результатам (табл. 1), достоверная разница между зольностью для вымытых и немытых растений выявлена только для образцов, отобранных на расстоянии 10 м и 50 м от дороги. При дальнейшем отдалении от дороги разница не достоверна.

Выявлена слабая корреляционная связь между содержанием золы общей в немытых и мытых листьях растения и расстоянием от дороги. Поскольку корреляция слабая, данный показатель в оценке антропогенного загрязнения листьев П. большого не информативен.

Государственная фармакопея (1989) разрешает использовать листья П. большого в качестве лекарственного растительного сырья, если содержание золы общей в них не превышает 20%. Данному критерию удовлетворяют все представленные образцы. Таким образом, нами выяснено, что общий минеральный остаток листьев растений, собранных на разном удалении от автотрассы, примерно одинаков. Судить о загрязненности исследуемого лекарственного сырья по данному параметру не представляется возможным.

.2 Определение массовой доли золы, не растворимой в соляной кислоте с массовой долей 10%

Количество золы, не растворимой в 10% растворе HCl - это показатель загрязненности растительного сырья преимущественно нерастворимыми соединениями SiO₂.

Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 Количество золы, не растворимой в 10 % HCl, на разном удалении от автотрассы

Согласно полученным результатам (табл. 2), достоверная разница между зольностью для вымытых и не мытых растений выявлена для образцов, отобранных на расстоянии 10 и 25 метров от дороги. При дальнейшем отдалении от дороги разница не достоверна. Возможно, отсутствие разницы между мытыми и немытыми листьями растения связано с обилием осадков в летний сезон 2009 года, пыль смывалась с листьев дождями. Выявлена достоверная отрицательная корреляция между содержанием золы, не растворимой в 10% HCl и расстоянием от дороги (r=-0,62). Данный показатель может служить критерием экзогенного загрязнения растительного сырья.

Государственная фармакопея (1989) разрешает использовать листья П. большого, если количество золы, не растворимой в 10% HCl не более 6 %. В образцах, собранных на удалении 10 м, нами выявлено превышение содержания данного показателя, причём, и в мытых и немытых растениях и 25 м от трассы - только в не мытых.

Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что существует обратная связь между удалённостью от дороги и количеством золы, не растворимой в 10% соляной кислоте. Придорожной полосой, в которой не рекомендуется собирать П. большой является 10 - 25 метров по данному показателю.

.3 Элементный состав листьев П. большого

Между содержанием ХЭ в мытых и немытых листьях П. большого достоверной разницы выявлено не было. Поскольку в промышленных масштабах лекарственное сырье заготавливается в естественном виде, мы сочли более целесообразным представить данные о содержании ХЭ в немытых растениях. Извлечение подвижной формы металлов из листьев растения проведено 10% соляной кислотой. Анализ полученных результатов позволяет условно выделить 2 группы ХЭ:

)        элементы, количество которых в растениях снижается с удалением от дороги - Cd, Fe, Mn, Pb (табл. 3);

)        металлы, количество которых в растениях увеличивается с удалением от дороги - Cu, Mg, Sr, Zn (табл. 4).

Таблица 3 Содержание подвижной формы элементов-поллютантов, мг/кг сухого в-ва (M±m)

Таблица 4 Содержание подвижной формы элементов-биофилов, мг/кг сухого в-ва (M±m)

Для всех элементов первой группы выявлена достоверная отрицательная корреляция между расстоянием от шоссе и их концентрацией в растениях. Максимальный коэффициент корреляции (-0,95) выявлен для свинца, хотя с 1 января 2003 года действует закон "Об ограничении оборота этилированного бензина в Российской Федерации". В качестве альтернативы антидетонационным алкилсвинцовым присадкам в России разрешены к использованию органические соединения марганца, железа. Возможно, с этим связан высокий коэффициент корреляции железа и марганца. Концентрация подвижной формы железа в растениях, собранных на 10 м от дороги, в 4 раза выше, чем в растениях, отобранных дальше 50 м. Марганец из выше представленных ХЭ является самым малотоксичным элементом, но он способен накапливаться в растениях. С выбросами автотранспорта в атмосферу поступает опасные соединения кадмия (Пархоменко Н.А., Ермохин Ю.И., 2005).

Количество элементов-биофилов в листьях увеличивается с отдалением от дороги, т.е. в растениях, находящихся в более благоприятных экологических условиях. Количество магния увеличивается с отдалением от дороги (r=0,7). Основная физиологическая роль магния связана с его вхождением в молекулу хлорофилла, а также он входит в состав запасного вещества - фитина, который используется в энергетическом обмене и как источник фосфорной кислоты (Сергейчик, 1997). Возможно, количество магния в придорожной зоне уменьшается из - за ингибирования фотосинтетических процессов. Концентрация подвижной формы стронция при удалении от дороги также растёт. При расчёте парной корреляции выяснилось, что стронций и магний являются в данных условиях синергистами (r=0,93). Концентрация цинка практически не меняется в зависимости от степени удалённости от автотрассы.

.4 Количество элементов в водном извлечении из листьев П. большого на разном расстоянии от автотрассы