Диагностика
Диагноз ставят на основании клинических симптомов и обнаружении телец включения в тканях больных животных. Для прижизненной диагностики рекомендуют слепую пункционную биопсию печени или эксцизионную биопсию слизистой из области пищеводных желез и кардии желудка, выполненной с помощью фиброэндоскопа. Можно брать биопсию кожи (на всю толщу кожного лоскута) из нескольких участков. Включения можно изредка обнаружить в миелоцитах и лимфоцитах костного мозга или мазках периферической крови. Однако, в цитологических образцах включения плохо прокрашиваются модификациями Романовского, а клеточный материал быстро разрушается вследствие осмотического шока. Образцы тканей, в которых включения были выявлены с помощью световой микроскопии, следует также исследовать с помощью ТЭМ для уточнения природы включений. Кроме того, желательно исследовать гистологический материал с помощью специальных окрасок на наличие нуклеиновых кислот. Рекомендуется также проводить электрофорез для выявления специфического 68-кД белка, но для этого пригоден только свежий или замороженный материал, не обработанный фиксаторами.
В последние годы были получены антивидовые сыворотки к IgG Boa constrictor на основании которых была разработана и тестирована непрямая ELISA (Lock, Jacobson, 2003) для обнаружения антител к ретровирусу. В качестве вирус-специфического антигена использовали очищенный штамм, выделенный от Boa constrictor с IBD в культуре клеток VH-1 в 2001г. (Jacobson, et al, 2001). Кроме того, были получены моноклональные антитела к 68кД-белку (Jacobson, Bissel, et al, 2004). Однако, ELISA пока не введена в практику. В Германии используют недавно разработанную nested-PCR на праймерах к вирус-специфической протеазе и обратной транскриптазе (Marschang, et al, 2006).
Эндогенные провирусы у рептилий обнаруживают с помощью ПЦР на субстрате культуры лейкоцитов (Huder, et al, 2002). Тем не менее, посмертное гистологическое исследование пока остается единственным практическим методом диагностики IBD, принятым во всех странах.
Дифференциальная диагностика
Клинически IBD необходимо дифференцировать с любыми инфекционными и неинфекционными заболеваниями, вызывающими неврологические нарушения, такими как менингоэнцефалит, полигиповитаминозы В, подагра, интоксикации, инсульт и т.п. При обнаружении включений в цитоплазме или ядрах клеток эпителиального типа или нейронах, необходимо определить природу этих включений. Обнаружение эозинофильных цитоплазматических включений с помощью световой микроскопии не уточняет диагноз IBD. Специальные гистохимические окраски могут помочь в определении нуклеинового материала телец включений, который может свидетельствовать о присутствии вирионов. Окраска метиловым зелёным пиронином используется для выявления РНК. Реакция Фёльгена используется для окраски ДНК, где акридиновый оранжевый окрашивает РНК в красно-желтый, а ДНК в желто-зеленый цвет.
У млекопитающих практически нет заболеваний не вирусной природы, при которых образуются внутриклеточные включения (Cheville, 1983). Исключением можно считать образование телец Маллори, которые состоят из гиалина. Отравление свинцом может быть причиной внутриядерных включений, представляющих собой свинцово - гистонные комплексы.(Cheville, 1983, Coffin, 1996). При вирусном заболевании рептилий могут возникать включения, содержащие вирусные компоненты, такие как капсид, нуклеиновый материал, однако включения без вирусного компонента тоже могут присутствовать при вирусных инфекциях, и не только в случае IBD. Это было продемонстрировано при парамиксовирусной инфекции, когда в цитоплазме эпителия протоков поджелудочной железы гремучников образовывались характерные эозинофильные включения, которые состояли исключительно из гомогенного белкового материала (Jacobson, 1989). Таким образом, если присутствуют включения, должны быть взяты пробы для исследования с помощью специальных окрасок на нуклеиновый материал, электрофорез для определения вирусного белка и сопоставление ультрамикроснимков, полученных с помощью ТЭМ, со структурной морфологией включений.
Терапия
Не разработана. Змеи с подтвержденным диагнозом IBD должны подвергаться эвтаназии. Единственное сообщение о попытке применения ингибиторов обратной транскриптазы для рептилий сделал Levine (2002). Автор использовал для терапии обыкновенного удава с лейкемической формой IBD препарат Trizivir (Glaxo, SmithKline), представляющий собой комбинацию трех ингибиторов ревертазы (abacivir, zidovudine и lamivuridine). Доза была рассчитана аллометрически от млекопитающих и составила по компоненту абацивира 5 мг на змею массой 32 кг каждые 72 часа. На фоне терапии нормализовалась картина крови, и змея начала брать корм. К сожалению, удав вскоре пал, и так как вскрытие не проводили, автор не смог сделать окончательного заключения об эффективности этой терапии.
Реовирусы
Большая группа вирусов, поражающих позвоночных, насекомых и растения. Вирионы представляют собой неконвертирующиеся икосаэдрические частицы размером 60-80нм, состоят из двойного капсида и сердцевины, содержащей 2-спиральную линейную РНК.
Семейство Reoviridae включает 9 родов.
Характеристика возбудителя
Впервые о вирусном эцефалите удавов, возможно, ошибочно, сообщил Axthelm (1989). Наиболее специфическое заболевание, связанное с поражением нижних отделов респираторного тракта, описано у полозов E.mollendorfi и E.taeniura (Lamirande, et al, 1999). При эпизоотической вспышке в группе аризонских королевских змей, L. pyromelana, отмечали поражение тонкого кишечника и печени (Reavill, et al, 2003). Вирус также был выделен от взрослой самки удава, B.constrictor, с характерной клиникой IBD (Schragen, Hetzel, et al, 2004). Эпизоотическую вспышку респираторного заболевания регистрировали в группе мохавских гремучих змей, C.scutulatus (Wellehan, et al, 2005). Кроме того, ретровирусы изолировали от клинически здоровых рептилий, собакоголовых удавов C.caninus; королевских питонов P.regius; полозов E.longissima, зеленого гремучника C.viridis, игуан I.iguana и Ctenozaura sp., зеленой ящерицы L.viridis.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения
У рептилий реовирусы вызывают острую летальную пневмонию, подострый трахеит, симптомы поражения ЦНС, поражение ЖКТ и печени, в редких случаях изолируются наряду с ретровирусами при IBD у удавов. Прижизненно может отмечаться снижение массы тела, отрыгивание корма, респираторный синдром.
На секции выявляли острую интерстициальную бронхопневмонию, некротизирующий колит или гепатит с образованием многоядерных формаций, серозную атрофию жира. Тельца включений обычно выявляются только с помощью ТЭМ в цитоплазме энтероцитов, гепатоцитов и альвеоцитов.
Антигенная вариабельность и родство
Во всех случаях, когда проводилось секвенирование вирурной РНК, вирус был отнесен к роду Orthoreovirus. Вирус охарактеризован как новый, отличающийся генетически от ортореовирусов птиц и млекопитающих.
Экспериментальная инфекция
Заражение тонкохвостых полозов E.taeniura изолятом, выделенным от спонтанно инфицированных полозов Меллендорфа E.mollendorfi и частичное выполнение постулатов Коха провели Lamirande, et al (1999). Группа Райчел Маршанг (Schragen, et al, 2004) инокулировала суспензию культуры вируса, выделенного от самки обыкновенного удава B.constrictor с клиникой IBD, 10 новорожденным удавам. Вирусную РНК обнаружили у всех инфицированных змей через 18 недель с помощью ПЦР и выдели вирус в культуре у части животных после эвтаназии.
Диагностика
Выделение вируса в культуре клеток сердца гадюки (VH-2), обнаружение вирусных частиц в тканях рептилий спомощью ТЭМ, ПЦР-диагностика (nested PCR) на праймерах к вирусной РНК-зависимой полимеразы ортореовируса млекопитающих и аквареовируса рыб (Wellehan, et al, 2005). Единственный разработанный серологический тест - РН (Marschang, et al, 2002).
Дифференциальная диагностика
При поражении легких дифференцируют с парамиксовирозом.
При поражении ЖКТ - с аденовирозом.
При поражении ЦНС - с ретровирозом (IBD).
Терапия
При эпизоотических вспышках в группах королевских змей и мохавских гремучников часть животных удалось сохранить, проведя поддерживающую терапию и профилактику вторичной инфекции цефтазидимом.
1.2 Парамиксовирусы
Представители подсемейства Paramyxovirinae поражают разные виды позвоночных. Вирионы - плеоморфные частицы диаметром 150-300нм, имеют нуклеокапсид спиральной симметрии и липопротеиновую оболочку, на поверхности которой имеются выступы длиной 8-12нм. Геном представлен односпиральной линейной молекулой минус-РНК. Подсемейство включает 3 рода.
Характеристика возбудителя
Впервые вирус был выделен во время эпизоотической вспышки в группе ямкоголовых гадюк Bothrops atrox, начавшейся в серпентарии (Швейцария) в 1973г. У змей внезапно развилась атония мышц и ступорозное состояние, после чего через несколько дней проявились симптомы острого респираторного заболевания (уже в терминальной стадии). На вскрытии у павших животных обнаружили большое количество кровянистого экссудата в легких и полости тела (Folsch, Leloup, 1976). Вначале болезнь посчитали обусловленной синегнойной палочкой, P.aerugenosa. Затем гомогенат легочной ткани ввели в полость аллантоиса яиц ложной водяной кобры C.gigas, что вызвало их гибель в течение 7 дней. Суспензия из яиц вызвала ЦПД в культуре клеток фибромы гремучей змеи при температуре 300С. Выделенный вирус, исследованный с помощью НЭМ, был определен как парамиксовирус (Clark, et al, 1979) и получил название FDLV (Fer-de-lance virus). После этого в 1980г. болезнь была описана Элиотом Якобсоном в США, и затем эпизоотические вспышки наблюдали во многих зоопарках США и Европы, включая Московский зоопарк (Кудрявцев и др., 2000). Вирус получил номенклатурное название OPMV (Ophidian paramyxovirus). В последние годы вирус был выделен у нескольких видов ящериц, как клинически здоровых (игуан, ксенозавров, аллигаторовых ящериц, смарагдового варана, тегу), так и имевших заболевание легких (Boyer, et al, 2005). Несколько эпизоотических вспышек за 2-летний период зарегистрировали в группе каймановых ящериц Dracaena guianensis (Jacobson, et al, 2000).
Клинические признаки и патологоанатомические изменения
К вирусу чувствительны настоящие и ямкоголовые гадюки, ложноногие змеи и, возможно, некоторые виды ужеобразных змей. На пике эпизоотической вспышки заболевание протекает остро (2-3 недели) или даже молниеносно (сутки), к концу эпизоотического процесса и у менее чувствительных видов принимая скорее подострое или хроническое течение (1-6 месяцев). При острой инфекции, особенно у гремучих змей, наблюдают экссудативную пневмонию, часто с геморрагическим экссудатом или открытым кровотечением из трахеи. Могут отмечаться острые неврологические расстройства: волнообразные движения, односторонние спастические явления, потеря установочного рефлекса. На вскрытии отмечают сильный интерстициальный отек и обильный экссудат в легком и полости тела. Гистологически отмечают пролиферацию выстилающих альвеолярных клеток II типа в легких, инфильтрацию гетерофилами, утолщение альвеолярных стенок. Воспалительные инфильтраты и кровоизлияния могут заполнять воздухоносные пространства. Кроме того, наблюдается интерстициальный отек и обширные очаги фиброза в поджелудочной железе. Наиболее характерные изменения - некроз эпителия протоков с преобладанием реактивной гиперплазии и синцитиальных клеток. При подостром и хроническом течении, характерном для старых гремучих змей, наблюдают ступорозное состояние, кахексию, периферические параличи, слизь в ротовой полости. Перед появлением клинических симптомов змеи могут пропускать 1-2 кормления. Смерть обычно наступает от сопутствующей бактериальной или грибковой пневмонии. У павших животных типичные макроскопические изменения, за исключением «пролиферативной» пневмонии, могут отсутствовать. Характерны очаги интерстициального фиброза, сконцентрированные вокруг протоков поджелудочной железы. Похожие изменения могут встречаться в желчных протоках, слюнных и ядовитых железах. В гистологических препаратах иногда можно наблюдать амфофильные внутриядерные и внутрицитоплазматические включения. В цитологическом материале, полученном из легких, специфические включения обычно не выявляются.
Антигенная вариабельность и родство
Для разработки генетических и серологических тестов было выделено 3 штамма OPMV: Fer-de-lance virus, Bush-viper virus и Neotropical virus. Результаты использования этих штаммов в нескольких лабораториях США показали, что между ними существует достоверный антигенный полиморфизм. Секвенирование 16 штаммов OPMV и сравнение по L и HN вирус-специфическим генам показало, что HN-ген имеет почти одинаковую длину во всех образцах, тогда как L-ген в некоторых случаях вообще не обнаруживается (Kik, et al, 2004). При парамиксовирусной инфекции ящериц позитивные серологические реакции на антиген OPMV выявляются только в редких случаях. При парамиксовирозе, подверженном с помощью НЭМ у водяной агамы не смогли выявить ни вирусной ДНК, ни матричной РНК, проводя ПЦР на праймерах для выявления OPMV (Boyer, et al, 2005). Вероятно, генетический и антигенный полиморфизм характерен и для вирусов, поражающих различные семейства змей.
Экспериментальная инфекция
Постулаты Коха при OPMV были выполнены Элиотом Якобсоном с соавторами (Jacobson, et al, 2000) на экспериментальной группе гремучников острова Аруба Crotalus unicolor. Через 4 дня после интратрахеальной инокуляции штамма OPMV (“Aruba rattlesnake virus”) отметили инфильтрацию гетерофилами интерстиция легких. Через 9 дней начались процессы гиперплазии эпителия, в инфильтрате появились лимфоциты и макрофаги в краниальном отделе легкого. Через 15 дней выраженные изменения захватывали все отделы легкого, а к 19-22 дню последовала гибель всех зараженных змей. К этому моменту в краниальном отделе легкого был выражен коагуляционный некроз, вакуализация альвеолярного эпителия в среднем отделе, наблюдались многочисленные эозинофильные тельца включений в цитоплазме альвеоцитов. С 4-го дня после заражения вирусный антген выявили в легком с помощью окраски ИФА. ТЭМ выявила гиперплазию альвеоцитов II типа и деструкцию клеток I типа. Выделение вируса в просвет альвеол наблюдали с 9 по 19 день после заражения. Ни у одного из животных за этот срок не выявили сероконверсию с помощью РТГА. Антитела в определяемом титре появляются у переболевших животных через 6-9 недель после инокуляции вируса. Постулаты Коха также были частично выполнены во время эпизоотической вспышки в группе каймановых ящериц (Jacobson, et al, 2000). Вирус выдели в культуре клеток VH-1, и затем супернатантом инокулировали клетки Vero, где вирус был выделен повторно.
Диагностика
Диагностируют все подозрительные случаи, касающиеся острых пневмоний пролиферативного характера или неврологических нарушений у чувствительных видов змей. Ставят диагноз на основании макроскопических изменений, гистологического исследования и НЭМ легочного экссудата. Вирус изолируют в культуре клеток VH-1, Vero или на куриных эмбрионах. Для уточнения диагноза применяют РИФ, для чего образцы тканей необходимо замораживать при -20 - 700С. Для выявления серопозитивных животных применяют РТГА, разработанную Элиотом Якобсоном (Jacobson, et al, 1981), который использовал первый изолированный штамм “Fer-de-lance virus”. В дальнейшем была разработана РТГА на основе штамма “Neotropical”. В настоящее время в США РТГА проводят только 3 лаборатории, каждая на основе собственного штамма. При этом перекрестные реакции к различным штаммам вируса могут заметно отличаться. Позитивным считается титр от 1:20. Змеи, перенесшие OPMV, могут иметь чрезвычайно высокие титры, более, более 10240. Для определения активной инфекции повторную пробу берут через 2-4 недели. Повышение титра более чем на одно разведение, указывает на активную инфекцию. Плазму для анализа берут с литиевым гепарином и транспортируют на сухом льду; требуется 0,2 мл плазмы.