Материал: В-Л-Быков-Цитогогия_и_общая_гистология
тва) последовательно регистрируется с помощью специальных детекторов со скоростью до нескольких десятков тысяч клеток в 1 мин. с построением соответствующих гистограмм (графиков распределения) содержания вещества. В некоторых случаях через капилляр пропускают неокрашенные клетки (форменные элементы крови) и оценивают распределение их размеров и формы.
Клеточная сортировка позволяет выделить клетки с определенными маркерными признаками (или их сочетанием) из клеточной суспензии. Процедура реализуется с использованием специального прибора - сортера (клеточного анализатора), работающего по принципу про-точного цитометра, но с возможностью формирования мелких капель, содержащих отдельные клетки, которые, в зависимости от наличия маркировочного сигнала, сортируются и направляются в различные контейнеры.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОГАНОВ, ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ПОД ЭЛЕКТРОННЫМ МИКРОСКОПОМ
В настоящее время в научных исследованиях и клинической диагностике широкое применение нашли два метода электронной микроскопии - трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия и сканирующая (растровая) электронная микроскопия, использующие соответствующие микроскопы - ТЭМ (ПЭМ) и СЭМ (РЭМ).
ТРАНСМИССИОННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия
основана на использовании пучка электронов, излучаемого электронной пушкой внутри колонны микроскопа в условиях высокого ускоряющего напряжения (40-100 кВ) и глубокого вакуума (10-4 мм рт. ст.). Фокусировка пучка осуществляется электромагнитными линзами, играющими роль конденсора, объектива и проектора. После прохождения через изучаемый объект, помещенный в колонну и обладающий в различных своих участках неравномерной электронной плотностью, пучок электронов направляется на флюорецируюший экран и создает плоскостное изображение объекта, которое фотографируется на пластинку или пленку (рис. 2-4).
- 26 -
Рис. 2-4. Схема устройства трансмиссионного электронного микроскопа. пучок электронов излучается электронной пушкой (ЭП), включающей катод (КА) анод (А), фокусируется электромагнитными линзами конденсора (КО), объективе ОБ) и проектора (ПРО). После прохождения через изучаемый объект (ИО) пучок электронов направляется на флюоресцирующий экран (ФЭ), создавая изображение объекта, которое регистрируется на фотопластинке или фотопленке (ФП).
ТЭМ дает возможность изучения объектов, размеры которых лежат как в пределах разрешения светового микроскопа, так и далеко за ними вплоть до уровня макромолекул). Его разрешение теоретически достигает 0.002 им, однако практически составляет 0.2-0.5 им, а для большинства биологических объектов - 1-2 нм. Увеличение ТЭМ равно 100-1000 тыс. раз.
Высоковольтный ТЭМ (с ускоряющим напряжением до 1000 кВ) обеспечивает более высокую скорость движения электронов, которые глубже проникают в объект. Этот микроскоп дает очень высокое разрешение и позволяет использовать более толстые срезы (до нескольких микрометров).
- 27 -
Взятие и обработка материала для исследования в трансмиссионном электронном микроскопе
Взятие материала для электронно-микроскопического исследования осуществляется так же, как и для описанного выше гистологического. Однако кусочки ткани имеют очень мелкие размеры (обычно 1-2 мм); после извлечения они должны немедленно помещаться в фиксатор во избежание аутолитических изменений и высыхания.
Фиксация материала производится чаще всего глутаралъдегидом; предпочтительно использование перфузионного метода. Дополнительная фиксация (постфиксация) производится четырехокисью осмия, который одновременно окрашивает клеточные структуры.
Заливка материала осуществляется в нолимеризуюпшеся синтетические эпоксидные смолы.
Резка залитого материала производится на специальном приборе - ультратоме с помощью стеклянных или алмазных ножей. Толщина получаемых ультратонких срезов составляет 30-50 нм (необходимость получения очень тонких срезов обусловлена низкой проникающей способностью электронов).
Полутонкие срезы (толщиной 0.5-1 мкм), обычно изготовляют на ультратоме перед получением ультратонких срезов. Их окрашивают толуидиновым синим и изучают под светооптическим микроскопом для ориентировки в изучаемом объекте. Поскольку такие препараты по качеству значительно превосходят обычные, полученные путем резки на микротоме залитого в парафин материала, поэтому их нередко специально готовят для использования в исследованиях, выполняемых на уровне светового микроскопа.
Окрашивание (контрастирование) срезов выполняют с помощью солей тяжелых металлов (свинца, осмия, урана и др.), которые в раз-личной степени связываются с отдельными структурными компонентами, придавая им неодинаковую электронную плотность. Окрашенные ультра тонкие срезы помещают на металлическую сетку и изучают в ТЭМ.
СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Сканирующая (растровая) электронная микроскопия основана на сканировании электронным пучком поверхности изучаемого объекта, что достигается благодаря его отклонению специальным устройством (дефлектором). Вторичные электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, воспринимаются детектором и фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение (рис. 2-5). Разре-
- 28 -
шение СЭМ ниже, чем ТЭМ и составляет около 3-10 нм, его увеличение равно 20 тыс. раз.
Обработка материала для исследования в СЭМ включает его фиксацию, высушивание и напыление на его поверхность металлов (золота, палладия или др.).
Рис. 2-5. Схема устройства сканирующего электронного микроскопа Пучок электронов, излучаемых электронной пушкой (ЭП), фокусируется электромагнитными линзами конденсора (КО) и объектива (ОБ). Он сканирует поверхность изучаемого объекта (ИО) благодаря его отклонению дефлектором (ДФ), который получает сигнал от генератора сканирования (ГС). Вторичные электроны (ВЭ), излучаемые поверхностью ИО, воспринимаются детектором (ДТ) и фокусируются на экране (ЭКР), создавая ее трехмерное изображение.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Электронно-микроскопическая цитохимия, электронномикроскопическая иммуноцитохимия и электронно-микроскопическая авторадиография представляют собой адаптацию соответствующих методов, начально разработанных для светооптической микроскопии, к использованию на электронно-микроскопическом уровне. Они позволяют выявлять различные вещества и изучал, процессы метаболизма на уровне отдельных клеток и их компонентов. Очевидно, что для выявле-
- 29 -
ния продуктов цитохимических реакций и маркеров, используемых в иммуноцитохимических реакциях, выполняемых на электронномикросконическом уровне, они должны обладать высокой электронной плотностью.
Электронно-микроскопический микроанализ (рентгеновский микроанализ) - метод, обеспечивающий выявление и количественную оценку содержания различных химических элементов в ультратонких или гистологических срезах, а также образцах, подготовленных для СЭМ. Основан на бомбардировке объекта узким пучком электронов, которая вызывает излучение им вторичных электронов и рентгеновских лучей. Последние улавливаются специальным детектором, который определяет их спектр, характерный для каждого химического элемента.
Методы замораживания-скалывания и замораживания-скалывания-
травления дают возможность изучения внутренней структуры мембран и поверхности мембранных структур клетки.
Метод замораживания-скалывания основан на быстром замораживании клеток в присутствии криопротектора при температуре жидкого азота (-196°С) и раскалывании в вакууме с помощью ножа. На поверхность скола, который часто проходит через гидрофобную середину билипидного слоя мембран, напыляют платину, органический материал удаляют, а полученный препарат (реплику) изучают под электронным микроскопом.
Метод замораживания-скалывания-травления используется для изучения наружной поверхности клеточных мембранных структур. В соответствии с этим методом, после быстрого замораживания и раскалывания блока производится его травление - сушка в вакууме для удаления воды. На протравленную поверхность напыляют платину и полученную реплику изучают под электронным микроскопом.
- 30 -