Статья: Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов при низкотемпературном закаливании Solanum tuberosum L

Все эксперименты проведены в 5-6 биологических повторностях и 3-4 аналитических. Статистическая обработка данных проведена в программе SigmaPlot 11. Данные представлены в виде средних значений и их стандартных ошибок.

Результаты исследования и обсуждение

Известно, что устойчивость растений к действию холода формируется в процессе закаливания при низких (но не повреждающих) температурах [2] и обусловливается структурно-функциональной перестройкой клеток, связанной с изменениями на молекулярном уровне, в зависимости от генотипа растений. Поэтому на первом этапе работы необходимо было убедиться, что закаливание растений картофеля при 3°С в течение 7 суток приводило к повышению их устойчивости к действию повреждающих температур. Поскольку низкие положительные температуры не вызывают у холодостойких растений визуальных повреждений, мы применили метод прямого промораживания растений с последующим определением их выживаемости. Показано, что после действия температуры -3°С в течение 18 ч растения обоих вариантов погибали, в связи с чем использовали температурную экспозицию -2°С в течение 18 ч. При этом режиме закаленные растения картофеля выживали, а незакаленные - погибали, что свидетельствует о достаточно высокой эффективности закаливания Solanum tuberosum L., сорта Юбилей Жукова (рис. 1).

Рис. 1 Контрольные (1) и закаленные (2) растения картофеля через сутки после промораживания при температуре -2°С (а) и -3°С (b) в течение 18 ч. Автор фото Н.В. Нарайкина

Изменения относительного содержания транскриптов генов растворимой стеароил-АПБ десатуразы, А12- и ю3(А15)-ацил-липидных десатураз хлоропластов представлены на рис. 2. За единицу принято нормализованное содержание транскриптов исследуемых генов у незакаленных растений. Показано, что относительное содержание транскриптов гена FAD7 оставалось стабильным и поддерживалось на уровне контроля. Для гена FAD6 наблюдали кратковременное повышение содержания транскриптов в первые два часа закаливания, что соответствует данным литературы [19]. К пятым суткам закаливания у генов FAD6 и FAD7 наблюдали статистически значимое снижение относительного содержания транскриптов.

Характер экспрессии гена SAD, кодирующего А9 стеароил-АПБ деса- туразу ЖК, резко отличался от остальных: относительное содержание его транскриптов снижалось в ходе закаливания в разной степени. Выбранный нами для исследования ген стеароил-АПБ десатуразы имеет высокую гомологию с геном SSI2 арабидопсиса. Из данных литературы известно, что мутант арабидопсиса с «выключеным» геном ssi2/fab2 имеет высокое содержание стеариновой (С18:0) ЖК и низкое содержание олеиновой (С18:1) ЖК. Несмотря на то, что в дополнение к SSI2 в геноме A. thaliana присутствуют гены еще шести подобных ферментов, их экспрессия не способна компенсировать мутацию в ssi2 [20]. То есть этот ген является ключевым в семействе генов стеароил-АПБ. Согласно данным литературы, этот фермент настолько активен, что практически весь новообразованный стеароил-АПБ быстро превращается в олеоил-АПБ [5, 13, 21]. Поэтому мы связываем снижение относительного содержания мРНК данного гена с некоторым угнетением биосинтеза С18 жирных кислот в условиях холодового стресса. Следует отметить, что в геноме картофеля обнаружено 13 генов, кодирующих растворимые ацил-АПБ десатуразы, образующие первую двойную связь, белки которых локализуются в строме хлоропластов, в связи с чем требуется дальнейшее изучение этой группы генов.

Данные по составу и содержанию ЖК липидов хлоропластов картофеля представлены в таблице. В липидах хлоропластов, выделенных из листьев контрольных растений как до, так и после закаливания, идентифицированы восемь различных остатков С16- и С18-ЖК, основными представителями которых являлись пальмитиновая (С16:0), гексадекатриеновая (С16:3^А7,10,13), линолевая (С18:2^а9,12) и а-линоленовая (С18:3^А9,12,15) ЖК, причем на долю а-линоленовой кислоты приходилось почти 60% от суммы ЖК хлоропла- стов. Следует отметить, что картофель, как и A. thaliana, относится к группе «16:3» растений, у которых в отличие от «18:3» растений в хлоропластах содержится значительное количество С16:3 ЖК [10].

За время низкотемпературного закаливания (3°С, 7 сут) состав ЖК мало изменялся. Анализ содержания ПНЖК показал, что в процессе закаливания происходило увеличение содержания пальмитиновой (С16:0) кислоты, что может свидетельствовать о повышении интенсивности синтеза ЖК de novo.

Рис. 2. Изменение относительного содержания транскриптов генов десатураз жирных кислот хлоропласте® растений картофеля в динамике низкотемпературного закаливания (3°С, 7 сут). SAD - растворимая Д9-АПБ десатураза, FAD6 - Д12-ацил-липидная десатарураза, FAD7 - ю3(Д15)-ацил-липидная десатураза и HSFA8 - БТШ А8 (контроль холодового воздействия). На оси Y «Относительные единицы транскрипции, RQ», на оси X «продолжительность закаливания, сут». RQ определено методом ДДС_Т. Данные прелставлены в виде средних значений и их стандартных ошибок с использованием f-критерия Стьюдента. * - Статистически значимое отличие от контроля (р < 0,05)

Соединение С16.0-АПБ, являющееся предшественником С16.0 ЖК, используется в разных путях биосинтеза. Так, оно может в дальнейшем удлиняться до стеароил-АПБ с помощью фермента кетоацилсинтазы II (КАС II) или С16.0 ЖК может отделиться от АПБ с помощью ацил-АПБ тиоэстеразы (фермент, принадлежащий к классу ацил-АПБ-гидролаз) и подвергаться дальнейшей десатурации в липидсвязанной форме или транспортироваться из пластид в ЭПР. Таким образом, снижение активности фермента КАС II (одного из ферментов многокомпонентной синтазы ЖК), который удлиняет С16.0-АПБ до С18.0-АПБ, может приводить к повышению содержания пальмитиновой кислоты. С другой стороны, повышение активности ацил-АПБ тиоэстеразы также может приводить к повышению содержания пальмитиновой ЖК. Так, в литературе имеются данные о повышении содержания транскриптов гена пальмитоил-АПБ тиоэстеразы почти в четыре раза после кратковременного действия закаливающей температуры на растения картофеля [19].

Кроме того, в настоящей работе наблюдали повышение содержания С1(Н^А7 ЖК, как известно, играющей положительную роль в поддержании текучести мембран, поскольку при низкой температуре необходимо не только повышение количества ЖК с большим числом двойных связей, но и увеличение содержания ЖК с меньшим числом углеродных атомов. Это может свидетельствовать о повышении активности Д7-десатуразы FAD5, которая специфически образуют С1(Н ЖК в ФГ и МГДГ хлоропластов соответственно.

Согласно нашим данным, представленным в таблице, содержание а-линоленовой ЖК - главной ПНЖК хлоропластов, к седьмым суткам закаливания поддерживалось на высоком конститутивном уровне и составляло 50% от суммы ЖК. Представляет интерес сравнить эти показатели с данными литературы, согласно которым у картофеля сорта Невский происходило повышение содержания а-линоленовой кислоты после низкотемпературного закаливания с 38 до 43% [22], но эти показатели оставались даже ниже, чем у изученного нами сорта. Широко известно, что а-линоленовая кислота (и ее структурный аналог - гексадекатриеновая кислота) имеет уникальное значение в жизни растений [23] благодаря системе двойных связей. Она способна принимать спиральную конформацию и образовывать комплексы с мембранными липидами. Такие комплексы галактолипидов с белками обеспечивают построение фотосинтетических субъединиц хлоропласта, оптимальную пространственную ориентацию гидрофильных структур хлорофилла и возможность беспрепятственного переноса электронов в безводной среде. Следует отметить, что незначительное снижение содержания ПНЖК может быть связано как со снижением относительного содержания транскриптов гена SAD (рис. 2), кодирующего А9 стеароил-АПБ десатуразу ЖК, участвующую в образовании олеиновой кислоты, так и с интенсификацией пероксидного окисления липидов при резком снижении температуры в начале закаливания. Так, ранее нами показано возрастание его интенсивности у картофеля к третьим суткам низкотемпературного закаливания с последующим снижением до уровня вегетирующих растений к шестым суткам закаливания [24].

Таким образом, среди изученных генов А9-, Д12-, ю3-десатураз хло- ропластов обнаружено кратковременное (через 2 ч закаливания) увеличение содержания транскриптов только гена FAD6, кодирующего Д12-ацил- липидную десатуразу хлоропластов. Относительная транскрипция гена FAD7, кодирующего единственную ю3-десатуразу хлоропластов, оставалась на неизменном уровне, что, вероятно, способствовало поддержанию высокого конститутивного уровня триеновых ЖК.

Изменение относительного содержания жирных кислот липидов хлоропластов в результате низкотемпературного закаливания (3°С, 7 сут) растений картофеля, мас % + m

Примечание. Мас % - отражает содержание ЖК относительно суммы ЖК, ± m - стандартная ошибка, * - статистически значимое отличие от контроля (р < 0,05)

Суммарная доля ПНЖК липидов хлоропластов картофеля в незакаленных растениях составляла почти 90% от общего содержания всех ЖК и за время низкотемпературного закаливания сохранялась на высоком уровне. Высокое содержание ПНЖК способствует поддержанию тилакоидных мембран хлоропластов в функциональном состоянии, что в свою очередь позволяет растениям картофеля реализовать прохождение других процессов, способствующих закаливанию растений к низким температурам [25].

Заключение

На основании полученных данных можно предположить, что закаливание изученного сорта картофеля в целом направлено на поддержание конститутивно высокого содержания ПНЖК хлоропластов в процессе закаливания и увеличение синтеза ЖК de novo. Повышение содержания транскриптов гена FAD6 в начале этого периода, по-видимому, способствовало сохранению и поддержанию в активном состоянии пула Д12-десатураз, осуществляющих синтез линолевой кислоты, благодаря чему растения были обеспечены достаточным количеством этих жизненно важных ЖК. Стабильно высокое содержание ПНЖК, входящих в состав мембранных липидов хлоропластов, на протяжении всего периода закаливания способствует поддержанию тила- коидных мембран хлоропластов в функциональном состоянии, что позволяет растениям картофеля успешно закаливаться к гипотермии.

Литература

1. Liu Y, Dang P., Liu L., He C. Cold acclimation by the CBF-COR pathway in a changing climate: Lessons from Arabidopsis thaliana // Plant Cell Reports. 2019. Vol. 38. PP. 511-- 519. doi: 10.1007/s00299-019-02376-3

2. Трунова Т.И. Растение и низкотемпературный стресс (64-е Тимирязевские чтения). М.: Наука, 2007. 54 с.

3. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Топчиева Л.В. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука, 2006. 143 с.

4. Lyons J.M. Chilling injury in plants // Annu. Rev. Plant. Physiol. 1973. Vol. 24. PP. 445-466.

5. Лось Д.А. Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений // Вестник РАН. 2005. Т 75. С. 338-345.

6. Harwood J.L. Lipids: structure and function // The biochemistry of plants / ed. P.K. Stumpf. New York: Acad. Press, 1980. PP. 1-55.

7. Iba K. Acclimative response to temperature stress in higher plants: approaches of gene engineering for temperature tolerance // Ann. Rev. Plant Biol. 2002. Vol. 53. PP. 225-244. doi: 10.1146/annurev.arplant.53.100201.160729

8. Chi X., Zhang Z., Chen N., Zhang X., Wang M., Chen M., Wang T., Pan L., Chen J., Yang Z., Guan X., Yu S. Isolation and functional analysis of fatty acid desaturase genes from peanut (Arachis hypogaea L.) // PLoS ONE. 2017. Vol. 12(12): e0189759. PP. 1-28. doi: 10.1371/ journal. pone.0189759

9. Ishizaki-Nishizawa O., Fujii T., Azuma M., Sekiguchi K., Murata N., Ohtani T., Toguri T. Low-temperature resistance of higher plants is significantly enhanced by a nonspecific cyanobacterial desaturase // Nat. Biotechnol. 1996. Vol. 14. PP. 1003-1006.

10. Lee S.H., Ahn S.J., Im YJ., Cho K., Chung C.-C., Cho B.H., Han O. Differential impact of low temperature on fatty acid unsaturation and lipoxygenase activity in figleaf gourd and cucumber roots // Biochem. and Biophys. Research Communications. 2005. Vol. 330. PP. 1194-1198.

11. Miquel М., James D., Dooner H., Browse J. Arabidopsis requires polyunsaturated lipids for low-temperature survival // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. PP. 6208-6212.

12. Crosatti C., Rizza F., Badeck F.W., Mazzucotelli E., Cattivelli L. Harden the chloroplast to protect the plant // Physiologia Plantarum. 2013. Vol. 147. PP. 55-63. doi: 10.1111/j.1399- 3054.2012.01689.x

13. Лось Д.А. Десатуразы жирных кислот. М.: Научный мир, 2014. 372 с.

14. Анисимов Б.В., Еланский С.Н., Зейрук В.Н., Кузнецова М.А. Сорта картофеля, возделываемые в России: справочное издание. М.: Агроспас, 2013. 144 с.

15. Rao X., Huang X., Zhou Z., Lin X. An improvement of the AAC_T method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis // Biostat. Bioinforma. Biomath. 2013. Vol. 3. PP. 71-85.

16. Lang E.G.E., Mueller S.J., Hoernstein S.N.W., Porankiewicz-Asplund J., Vervliet- Scheebaum M., Reski R. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as theb for sub-cellular proteomics // Plant Cell Rep. 2011. Vol. 30. PP. 205-215. doi: 10.1007/s00299-010-0935-4

17. Маали Амири Р, Голденкова-Павлова И.В., Юрьева Н.О., Пчелкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г., Дерябин А.Н., Трунова Т.И., Лось Д.А., Носов А.М. Жирнокислотный состав липидов растений картофеля, трансформированных геном Д12-десатуразы цианобактерий // Физиология растений. 2007. T. 54. C. 678-685. doi: 10.1134/S1021443707050056

18. Сидоров Р.А., Жуков А.В., Верещагин А.Г., Цыдендамбаев В.Д. Низшие алкиловые эфиры жирных кислот из плодов бересклета // Физиология растений. 2012. T. 59. C. 362-368. doi: 10.1134/S1021443712030156

19. Koc I., Vatansever R., Ozyigit I. I., Filiz E. Identification of differentially expressed genes in chilling-Induced potato (Solanum tuberosum L.); a data analysis study // Appl. Biochem. Biotechnol. 2015. Vol. 177. PP 792-811. doi: 10.1007/s12010-015-1778-9