Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов при низкотемпературном закаливании Solanum tuberosum L
Н.В. Нарайкина, В.Н. Попов, К.С. Миронов,
В.П. Пчелкин, Т.И. Трунова, И.Е. Мошков
г. Москва
Аннотация
Исследованы изменения относительного содержания транскриптов генов A9-(SAD), A12-(E4D6) и rn3-(EAD7) десатураз хлоропластной локализации в процессе низкотемпературного закаливания (3°С, 7 сут) растений Solanum tuberosum L., сорт Юбилей Жукова. Среди изученных генов в начале периода закаливания обнаружено почти 3-кратное кратковременное увеличение относительного содержания транскриптов гена EAD6, кодирующего А12-ацил- липидную десатуразу хлоропластов. В процессе закаливания содержание транскриптов гена EAD7, кодирующего и>3(А15)-ацил-липидную десатуразу, поддерживалось на уровне вегетирующих растений, а гена SAD, кодирующего одну из стеароил-АПБ десатураз, - снижалось. Суммарная доля полиненасыщенных жирных кислот липидов хлоропластов в незакаленных растениях достигала почти 90% от общего содержания всех жирных кислот (ЖК) и за время закаливания поддерживалась на высоком конститутивном уровне. Обнаружено увеличение содержания пальмитиновой (Сш) кислоты, что может свидетельствовать о повышении интенсивности синтеза ЖК de novo. Кроме того, показано повышение содержания С16:1А7 кислоты, что также является важным для закаливания, поскольку поддержание текучести мембран определяется в том числе и содержанием ЖК с меньшим числом углеродных атомов. Сделано предположение, что повышение относительного содержания транскриптов гена EAD6 в начале закаливания и поддержание транскрипции EAD7 способствовало сохранению хлоропластных мембран в нативном состоянии и повышению устойчивости растений картофеля к гипотермии в процессе закаливания.
Ключевые слова: Solanum tuberosum; холодоустойчивость; промораживание; относительное содержание транскриптов; SAD; EAD6; EAD7; а-линоленовая кислота; полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК).
Annotation
транскрипт ген дематураза закаливание
Natalia V. Naraikina, Valery N. Popov, Kirill S. Mironov, Vasily P. Pchelkin, Tamara I Trunova, Igor E. Moshkov
K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation
Fatty acid desaturase gene transcription at Solanum tuberosum L. cold adaptation
The problem of the survival of plants under low temperatures becomes more relevant in the light of global climate change and the growing needs of the population. In this regard, studies of the impact of hypothermia on plants are not only fundamental, but also applied. Potatoes are an important food crop, ranking fourth in the world in terms of growing. The actual yield of potatoes is significantly lower than its potential productivity, and one of the limiting factors is the lack of resistance of many modern varieties to spring frosts. Decoding of the potato genome made it possible to use advances in molecular biology to study the role of individual genes and identify key proteins that can increase resistance to low temperature. It is widely known that under the action of low temperatures, there is a phase transition of membrane lipids, which is accompanied by a decrease in membrane fluidity and loss of their barrier properties and, as a result, by inactivation of enzymes. In response to changes in physical properties of membranes, cells activate protection systems, among which an important role is played by the cold-induced increase in the degree of unsaturation of fatty acids of membrane lipids. Therefore, one of the main goals of adaptation is the stabilization of membranes, for example, due to the work of enzymes, fatty acid desaturase (encoded by genes FAD), catalyzing the conversion of saturated fatty acids (FA) into unsaturated. Among all plant cell membranes, chloroplast membranes play a special role in the formation of plant resistance to low temperatures, since it is in chloroplasts that photosynthesis, the main source of energy necessary for the restructuring of metabolism during the adaptation period, takes place. The aim of the research was to study the role of chloroplast localized A9-, A12 - and i»3(A15)-desaturases in adaptive transformations of the fatty acid composition of chloroplast membranes when forming potato plant cold resistance during hardening.
The object of the study was potato plants (Solanum tuberosum L., cultivar Jubilee Zhukov), 3 weeks of age, grown in soil culture at a temperature of 22°C, illumination of 100 pmol/(m2 c) and 16-h photoperiod. Hardening of plants was carried out in the climatic chamber KBW-240 “Binder” (Germany) under 16-h photoperiod and illumination of 100 pmol/(m2c) at a temperature of 3°C for 7 days. Controls were non- hardened plants. To assess the effectiveness of adaptation, whole plants were frozen at a temperature of 2°C for 18 hours in the climatic chamber MIR-153 “Sanyo” (Japan), and then transferred to the growing conditions to determine survival. The following genes of FA desaturases were selected for the study: SAD (encodes one of the soluble A9- ACP-), FAD6 (encodes membrane-bound acyl-lipid A12-), FAD7 (encodes membrane- bound acyl-lipid A15(ro3)-desaturase). Protein products of these genes are localized in chloroplasts. Total RNA from leaves was isolated using Spectrum Plant Total RNA Kit “Sigma” (USA). The reverse transcription reaction was performed using a set of reagents and the Protocol MMLV RT Kit “Eurogen” (Russia). The resulting cDNA was used for real-time PCR (q-PCR) using the amplifier CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System “Bio-Rad” (USA), using a set of reagents qPCRmix-HS SYBR kit “Eurogen” (Russia). The relative transcript content was calculated by calculating the normalized expression (AACT). Primers for the genes of FA desaturases were selected using the database NCBI and Internet resource Primer3Plus. Intact chloroplasts were isolated by centrifugation in a percol step gradient. Chloroplast lipids were methylated by boiling in a mixture of CH3OH and CH3COCl. The obtained LC methyl esters were analyzed by GL-MS using Agilent 7890A GC (USA). The experiments were conducted in 5-6 biological replicates and 3-4 analytical ones. Statistical data processing was performed using the program SigmaPlot 11. The data are presented as means and their standard errors.
We showed that the hardened potato plants survived after -2°C for 18 h, which indicates the successful hardening of S. tuberosum, Jubilee Zhukov cultivar (See Fig.
1). Among the studied genes A9-, A12- and i»3-desaturases of chloroplasts, a short-term (after 2 h of adaptation) increase in the transcripts of the FAD6 gene encoding acyl- lipid A12-desaturase was found. The relative content of FAD7 gene transcripts encoding ro3-desaturase remained stable and maintained at the level of control. The character of SAD gene expression encoding A9-ACP desaturase differed from the others: the relative transcript content decreased during adaptation (See Fig. 2). It should be noted that potatoes have 13 soluble A9-ACP-desaturase genes forming the first double bond, whose proteins are localized in the stroma of chloroplasts. Perhaps, the studied gene is not cold-inducible. The total percentage of polyunsaturated fatty acids (PUFA) of lipids in chloroplasts of potato was high and constitutive in non-hardened plants accounted for almost 90% of the total content of all FA (See Table). Probably, therefore, in the process of adaptation there was no noticeable increase in the relative content of the transcripts of the studied genes A12- and ro3-desaturases of chloroplasts. During the period of low-temperature hardening, the part of PUFA, and especially a-linolenic acid, was maintained at a high level; there was an increase in the content of palmitic acid, which may indicate an increase in the intensity of synthesis of FA de novo. In addition, an increase in the content of C16. 1A7 acid was observed, which is also important for adaptation. It is known that the fluidity of membranes with decreasing temperature is determined not only by the content of FA with a larger number of double bonds, but also by the content of FA with a smaller number of carbon atoms. Maintaining a high amount of PUFA helped to maintain the thylakoid membranes of chloroplasts in a functional state during the hardening process, which, in turn, allowed the potato plants to realize other processes of adaptation.
The paper contains 2 Figures, 1 Table and 25 References.
Key words: Solanum tuberosum; low-temperature adaptation; cold resistance; relative transcript content; SAD; FAD6; FAD7; a-linolenic acid; polyunsaturated fatty acids (PUFA).
Введение
Проблема выживания растений в условиях действия низких температур становится все более актуальной в свете глобальных изменений климата и возрастающей потребности населения в продовольствии. В связи с этим исследования воздействия гипотермии на растения имеют не только фундаментальный, но и прикладной характер [1, 2]. Картофель - важная продовольственная культура, занимающая четвертое место в мире по объемам производства после пшеницы, риса и кукурузы. Развитие его клубней зависит от температурных условий выращивания. Реальная урожайность картофеля существенно ниже его потенциальной продуктивности, причем одним из главных ограничивающих урожай факторов является недостаточная устойчивость многих современных сортов к весенним заморозкам [3]. В связи с этим поиски путей повышения урожайности картофеля тесно связаны с фундаментальными исследованиями процессов формирования устойчивости растений к гипотермии.
В литературе широкое распространение получила теория, согласно которой при пониженных температурах происходит фазовый переход мембранных липидов, приводящий к снижению текучести мембран, инактивации мембранных ферментов, потере барьерных свойств мембранами и как результат, к гибели клеток [4]. Клетки растений способны поддерживать текучесть мембран за счет работы ферментов из группы дегидрогеназ - десатураз жирных кислот (ЖК), катализирующих превращение одинарной (С-С) связи между атомами углерода в ацильных цепях ЖК в двойную (С=С). В ходе этой реакции насыщенные ЖК превращаются в ненасыщенные, что приводит к изменению свойств мембранных липидов. Десатуразы работают строго последовательно, продукт каждой реакции служит субстратом для последующей [5, 6]. Для высших растений большая часть информации о функциях и специфичности десатураз ЖК получена при изучении мутантов Arabidopsis thaliana, отдельных по специфичной десатуразной активности [7]. Известно, что десатуразы арабидопсиса (FAD - fatty acid desaturase) подразделяются на несколько подсемейств. Стеароил-АПБ десатураза (FAB2 или SSI2) является растворимой десатуразой и катализирует десатурацию стеариновой кислоты (C18.0) до моноеновой олеиновой (C18.jA9) ЖК в связанной с ацилпереносящим белком (АПБ) форме. Кроме того, у арабидопсиса имеется Д9-ацил-липидная десатураза (ADS), которая участвует в десатурации С16.0 в ЭПР. Микросомальная десатураза FAD2 и хлоропластная десатураза FAD6 представляют собой Д12-ацил-липидные десатуразы, которые участвуют в образовании диеновой линолевой кислоты (С18.2Д9,12) в эндоплазматическом ретикулуме и пластидах соответственно. Микросомальная ю3(Д15)-десатураза FAD3 и пластидные ю3(Д15)-десатуразы FAD7, FAD8 участвуют в образовании линоленовой (С18.3Д9,12,15) ЖК. Хлоропластные транс Д3-десатураза (FAD4 или FADA) и Д7-десатураза (FAD5) специфически образуют C16.j в ФГ и МГДГ соответственно. Кроме того, имеются специфичные Д8- и Д4-десатуразы сфинголипидов (SLD и DES) [8]. При этом основная роль в поддержании текучести мембран хлоропластов отводится Л12- и ю3-ацил-липидным десатуразам, участвующим в образовании полинена- сыщенных ЖК (ПНЖК) с двумя и тремя двойными связями соответственно [9,10]. Так, мутант A. thaliana по гену FAD6 с неактивной хлоропластной Д12-десатуразой накапливал высокие концентрации пальмитолеиновой (С16:1) и олеиновой (С ) кислот. При этом уменьшалось содержание диеновых и трие- новых ЖК в галактолипидах хлоропластов и наблюдалось снижение устойчивости к низкой температуре [7, 11].
Среди всех мембран растительной клетки хлоропластные мембраны играют особую роль в формировании устойчивости растений к низким температурам, поскольку именно в хлоропластах происходит фотосинтез, продукты которого служат основным источником энергии, необходимой для перестройки клеточной структуры и метаболизма, происходящей в период низкотемпературного закаливания [12]. В тилакоидных мембранах растений картофеля локализованы А12-десатураза FAD6, а также единственная ю3-деса- тураза FAD7, хотя, согласно данным литературы, в хлоропластах многих других растений присутствуют две ю3-ацил-липидных десатуразы - FAD7 и FAD8, причем экспрессия последней индуцируется низкой температурой [7, 8, 13]. Кроме того, у картофеля имеются растворимые стеароил-АПБ десатуразы (SAD) в хлоропластах, участвующие в образовании первой двойной связи в положении А9 у их субстрата - стеароил-АПБ. Именно данные гены выбраны нами для анализа изменений относительного содержания транскриптов в процессе закаливания растений картофеля к гипотермии. Цель работы - исследование роли А9-, А12- и ю3(А15)-ацил-липидных десатураз хлоропласт- ной локализации, задействованных в биосинтезе основных моно-, ди-, и три- ненасыщенных жирных кислот, в преобразованиях жирнокислотного состава мембран хлоропластов в процессе формирования холодостойкости растений картофеля при низкотемпературном закаливании.
Материалы и методики исследования
Объект исследования - растения картофеля (Solanum tuberosum L., c. Юбилей Жукова), которые выращивали из клубней в течение 3 недель в торфогрунте (50% верхового торфа, 50% пойменной земли с добавлением перлита) при температуре 22°С, освещенности 100 мкмоль/(м2 с) и 16-часовом фотопериоде в камере фитотрона ИФР РАН (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН). Сорт Юбилей Жукова в Госреестре с 2000 г., выведен ВНИИКХ им. А.Г. Лорха, описан как экологически пластичный, устойчивый к вирусным болезням, альтериозу, среднеустойчивый к фитофто- розу, парше обыкновенной и ризоктониозу [14]. По отношению к пониженным температурам почвы описан как относительно устойчивый [14]. Закаливание растений проводили в климатической камере KBW-240 «Binder» (Германия) в условиях 16-часового фотопериода и освещенности 100 мкмоль/(м2 с) при температуре 3°С в течение 7 суток. В качестве контроля использовали растения, не подвергнутые действию закаливающей температуры.
Для оценки эффективности закаливания целые растения картофеля промораживали при температуре -2°С в течение 18 часов в климатической камере MIR-153 «Sanyo» (Япония), затем их переносили в нормальные условия выращивания (22°С) и через двое суток визуально оценивали выживаемость.
Для выделения РНК использовали листья 3-4-х ярусов, которые отделяли от растений контрольной группы (22°С) до начала закаливания, а также растений, находившихся в условиях закаливания при 3°С в течение двух часов, 1, 3, 5, и 7 суток.
Тотальную РНК из листьев растений выделяли с помощью набора Spectrum Plant Total RNA Kit «Sigma» (США) согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили, используя набор реагентов и протокол MMLV RT Kit «Евроген» (Россия). Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью амплификатора CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System «Bio-Rad» (США), используя набор реагентов qPCRmix-HS SYBR kit «Евроген» (Россия). Расчет относительного содержания мРНК гена в пробе проводили с помощью вычисления величины нормализованной экспрессии (AACT). Эффективности ОТ-ПЦР, рассчитанные методом калибровочных кривых для всех пар праймеров, учитывали при проведении анализа [15]. Праймеры к исследуемым генам десатураз ЖК подобраны с использованием базы данных NCBI и интернет-ресурса Primer3Plus: SAD (LOC 102577562) - (F) CCAGTGAAGGACGCAGAGCAC, (R) GGGACTTCGTTGCTTGGCCC; FAD6 (LOC 102590621) - (F) GCACGAAGACACAGCTTGGC, (R) TGACAGAGCCACCAGTGAGC); FAD7 (LOC 102597672) - (F) TCTACCCTTTCCCTTGCTGGCA, (R) CATTGCCGTCCAGCAGACAGT; к референсньгм генам: фактор элонгации 1а eEFla (LOC DQ252497) - (F) GGCCAACAGACAAACCCCTCC, (R) GCCTCGTGGTGCATCTCAACA; ри- босомальный белок L2 (LOC 102577640) - (F) GGAGCCAAAAAGATTGTGCCC, (R) AGCAGTTCCTCTTCACACGG. В качестве контроля ответной реакции на действие холода использовалиген белкатеплового шока (БТШ)ЖК4$ (LOC 102594276) - (F) TCCAGCTTCATTCGTCAACTCAAC, (R) CTCCTCCAGCTGGGATGGTT.
Интактные хлоропласты выделяли в буфере, содержащем 0,33 М сорбит, 50 мМ трицин рН 8.0, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2, 5 мМ меркаптоэтанол. Гомогенат фильтровали через 2 слоя Miracloth (США), центрифугировали при 2000 g, используя центрифугу K23D (Германия). Осадок ресуспендиро- вали в буфере, наслаивали на ступенчатый градиент перкола (40/80%). Интактные хлоропласты отбирали на границе 40 и 80% перкола. [16]. Липиды хлоропластов подвергали метилированию посредством кипячения в смеси CH3OH и CH3COCl в течение 1 ч, как описано ранее [17]. В качестве внутреннего стандарта использовали маргариновую кислоту. Полученные метиловые эфиры ЖК очищали с помощью ТСХ на пластинке с силикагелем, в качестве растворителя применяя смесь гексан: эфир: уксусная кислота в соотношении 90:10:1, экстрагировали бензолом и анализировали методом ГЖХ-МС на приборе Agilent 7890A GC (США) [18]. Для оценки уровня не- насыщенности ЖК в липидах мембран хлоропластов табака рассчитывали индекс ненасыщенности (ИН): ИН = XPiei/100, где Pi - содержание i-той ЖК (%), ei - число двойных связей в i-той ЖК [17].