Згідно лектинової гіпотези, яка пояснює механізм формування симбіотичної системи, полісахариди ризобій є фактором, що забезпечує «розпізнавання» бульбочковими бактеріями відповідного їм рослини-господаря в результаті комплементарного зв'язування з рослинним лектином.
Прикріплення клітин ризобій до кореневого волоска відбувається у дві фази. Первинне прикріплення ризобій до кореневих волосків відбувається завдяки взаємодії ЕПС ризобій із рецепторами лектинів рослини. Таким чином забезпечується перша фаза слабоспецифічного зв’язування клітини з поверхнею кореня. У подальшому розпізнавання партнерів відбувається завдяки взаємодії детермінантних груп ліпополісахаридів (ЛПС) клітинної стінки ризобій з активним центром лектину рослини. Ступінь спорідненості ліпополісахаридів різних штамів бульбочкових бактерій до лектину рослини-живителя зумовлює специфічність взаємодії партнерів і визначається вмістом функціональних вуглеводів в О-ланцюжках ЛПС. За присутності лектину значно зростає питома швидкість росту і накопичення біомаси ризобій. Лектини, одержані з насіння високочутливих до інокуляції сортів, здатні стимулювати ріст ризобій.
Коріння бобових рослин виділяють специфічні сполуки, які індукують транскрипцію бактеріальних nod-генів (генів нодуляціі). Існують різні групи речовин, що грають роль молекулярних сигналів обміну між бобовими рослинами і ризобії під час розвитку симбіотичного апарату. Серед речовин, які постійно виділяють рослини в ризосферу, особливе значення мають флавоноїдні сполуки. Після прикріплення у бактерій спостерігається реакція на рослинні флавоноїди, що містяться у насінні і коренях рослин. Флавоноїди взаємодіють з бактеріальним білком NodD, який зв’язаний із внутрішньою мембраною ризобіальної клітини. При взаємодії з флавоноїдами білок NodD змінює свою конформацію, в результаті чого він може активувати транскрипцію генів нодуляції - nod-генів, що контролюють синтез Nod-факторів, які за хімічною будовою є ліпо-хіто-олігосахаридами, що складаються із 3-6 залишків N-ацетилглюкозаміну і радикалу ненасиченої жирної кислоти (С16-С20). Ці сполуки, впливаючи на клітини кореня, провокують деформацію кореневого волоска, що сприяє проникненню ризобій у корінь через інфекційну нитку. Під їх впливом здійснюється розподіл кортикальних клітин і утворення зародкових бульбачок. Ліпохітоолігосахариди не тільки допомагають ризобіям проникати в корені, але й стимулюють синтез рослинами флавоноїдів і виділення їх корінням. Вивчення структури та механізмів біосинтезу Nod-факторів у ризобій показало, що їх синтез контролюється генами вірулентності, одні з яких є загальними для всіх видів, у той час як інші є специфічними для окремих видів бульбочкових бактерій і навіть штамів. Перша група генів вірулентності контролює синтез корової частини Nod-фактора, а друга - його модифікацію. Цей процес відбувається за допомогою приєднання різноманітних радикалів до олігосахаридної частини молекули. Можливо, що такі модифікації на кінцях сигнальної молекули захищають Nod-фактор від деградації рослиною.
Другим етапом формування симбіотичного системи є інфекція та розвиток бульбочок. У місці різкого вигину волоска пектолітичні ферменти бактерій руйнують клітинну стінку кореня, через яку ризобії проникають всередину. При електронно-мікроскопічних дослідженнях виявлені чіткі зони гідролізу клітинної стінки з адсорбованими ризобіями в місці інфекції. Ризобії можуть володіти пектинолітичною, протеолітичною, β-глюкозидазною активністю, а також активністю кислої і лужної фосфатаз. Доведено, що передує проникненню ризобій розм'якшення стінок кореневих волосків (або кореня) пов'язане з їх здатністю продукувати ферменти пектинруйнуючого комплексу.
Навколо ризобій утворюється порожнина - інфекційна нитка, стінки якої вислані рослинними клітинами, а внутрішній простір заповнений полісахаридами рослини і мікросімбіонта. ‘‘Загальні” nod-гени контролюють процес скручування волосків, а специфічні nod-гени - більш пізню стадію формування інфекційної нитки.
Інфекційна нитка знаходиться у міжклітинному просторі і за 2-3 доби досягає основи кореневого волоска. Одночасно з цими подіями відбувається закладення бульбочкової меристеми внаслідок мітотичної реактивації, диференціації і проліферації клітин кортекса. Ця стадія називається Ced (від англ. Cortical cell division - поділ). Далі починаються процеси гістогенезу, диференціації тканин бульбочки, стадія Ntd (від англ. Nodule tissue differentiation). У кінці цієї стадії вже сформовані покривна, провідна й азотфіксуюча тканини бульбочки. В цей час інфекційна нитка дістається до основи кореневого волоска, проникає в кортекс, а потім у бульбочку. В наступній заключній стадії Ваr (від англ. Bacterial release) відбувається перехід ризобій із інфекційної нитки в рослинну клітину. У місці випинання інфекційної нитки утворюються тимчасові структури - інфекційні краплини, від яких відділяються мембранні кульки, що містять бактерії. Таким чином ризобії всередині рослинної клітини оточені перибакгероїдними мембранами за участю тілець апарату Гольджі та ендоплазматичного ретикулума. Цей комплекс носить назву симбіосома і є основною субклітинною одиницею симбіозу. Після утворення симбіосом ризобії з паличковидної форми переходять у стадію бактероїдів
Мікроорганізми при цьому змінюються: втрачають клітинну стінку, змінюють свої розміри, форму і морфологію. Бактероїди мають в 3-5 разів більші розміри, ніж вільноживучі бактерії. Крім того, всі вони покриваються рослинним білком - леггемоглобіном. У зрілому бульбочку клітини рослини повністю заповнені бактероїдами. Ця стадія називається Bad (від англ. Bacteroid differentiation). У цей період відмічається репресія генів, відповідальних за автономний ріст. У бактероїдах активується синтез нітрогенази, яка каталізує відновлення N2 до NH4, а також ферментів, які обслуговують нітрогеназну реакцію. Після цього починається фіксація атмосферного азоту стадія Nif від англ. Nitrogen fixation. У цей період відбувається активне ділення і диференціація рослинних клітин, у результаті чого тканина кореня розростається і утворюється здуття - бульбочка. Основними одиницями сформованої бульбочки є інфікована ризобіями тканина, провідні пучки для продуктів рослинного фотосинтезу і відтоку продуктів азотфіксації, апікальна меристема, за рахунок якої відбувається ріст бульбочки. Увесь процес інфекції – від інокуляції до утворення бульбочок - триває 3-4 тижні.
Розвиток ризобій у бульбочках контролюється рослиною, тому що неврегульоване розмноження бактерій може нанести шкоду для хазяїна. Після інфікування кореня й утворення бульбочок нодуляція вже не відбувається на молодих коренях, які продовжують рости. При утворенні симбіозу у бобових виявлені процеси, схожі з захисними реакціями рослин при їх пошкодженні фітопатогенними бактеріями: синтез етилену, фенолів, хітиназ, пероксидаз. На відміну від патогенезу, результатом якого є інактивація мікрооорганізму, при симбіозі відбувається регуляція розмноження ризобій. У той же час бульбочкові бактерії також проявляють ряд захисних реакцій щодо рослин. Наприклад, захисною реакцію є синтез екзополісахаридів, який кодується ехо-генами.
У міру формування симбіозу проявляються такі важливі для селекції рослин ознаки, як азотфіксуюча активність (швидкість відновлення N2 в NH4 +) та симбіотична ефективність (здатність рослин інтенсивно розвиватися, використовуючи сімбіотрофне харчування азотом). З часом бульби старіють, тобто бактероїди і клітини рослини-господаря піддаються процесам деградації.
Утворення аміаку з N2 - екзотермічна реакція. N2 - надзвичайно стабільна молекула, вона містить потрійний зв'язок, і енергія, необхідна для активації цього зв'язку, дуже велика. Енергетичне забезпечення азотфіксації здійснюється за рахунок продуктів фотосинтезу рослин у формі сахарози; для азотфіксації рослина здійснює анаеробний етап - гліколіз, у результаті якого у бактероїди надходять С4-дикарбонові кислоти (сукцинат і малат). Таким чином, на долю мікросимбіонту припадає найбільш енергетично вигідна частина катаболізму - цикл трикарбонових кислот (ЦТК), у який можуть безпосередньо включатися сукцинат і малат.
У модельних експериментах з очищеними компонентами нітрогеназної системи можна доставляти енергію у вигляді АТФ і відновну силу у формі відновлених піридиннуклеотидів і ферредоксинів, використовуючи переносники, що містять флаводоксін.
Відновлений ферредоксин або флаводоксін переносить електрони на Fe-білок. При надлишку енергії, що виділяється в результаті гідролізу АТФ, потенціал окисно-відновних груп ферменту продовжує знижуватися, приводячи зрештою до утворення супервідновленого МоFe-білка, який зв'язує N2. Зв'язування молекули N2, мабуть, відбувається шляхом її впровадження у два метал-водневі зв'язки, утворені за участю молібдену.
Для активної роботи нітрогенази необхідні мікроаерофільні умови, які в бульбочках забезпечуються дифузним бар'єром (шар щільно прилеглих один до одного клітин у внутрішньому кортексе) і синтезом леггемоглобіну. Леггемоглобін зв'язує О2, транспортує його до сімбіосом, забезпечуючи дихальну активність бульбочок. Бульбочкові бактерії - аероби, і кількості кисню, що надходить в бактероїди за участю леггемоглобіну, цілком достатньо для синтезу АТФ в дихальному ланцюзі, але не настільки велике, щоб інактувати нітрогеназу.
Фіксований азот асимілюється у формі амонію, який включається у метаболізм рослинної клітини (первинна асиміляція), потім утворюються транспортні форми фіксованого азоту (наприклад, глутамін, аспарагін, алантоїн), які надходять із бульбочок до провідної системи кореня. Далі відбувається перерозподіл фіксованого азоту поміж різними органами рослин. Для сільськогосподарських культур важливого значення набуває накопичення зв’язаного азоту у зеленій масі кормових культур або у зерні. Це значно підвищує вміст білка і кормову або харчову цінність рослинницької продукції.
У багатьох діазотрофів нитрогеназа утворюється тільки тоді, коли вона необхідна, тобто за відсутності відповідного джерела зв'язаного азоту. Іони амонію пригнічують синтез нітрогенази. При низькій концентрації амонію його первинна асиміляція у більшості мікроорганізмів відбувається за рахунок послідовних реакцій, які каталізуються глутамінсинтетазою (ГС) і глутаматсинтазами (ГОГАТ). При цьому утворюється глутамін, а потім глутамат - центральний метаболіт синтезу амінокислот і ряду інших біологічно активних речовин. ГОГАТ каталізує відновного амінування α-оксоглутарата, використовувуючи як донори електронів НАДН або НАДФН, відновленний фередоксин.
Реакції, які катализируются ГС-ГОГАТ системою, є основним шляхом асиміляції амонію у ризобій. ГС на ряду з каталітичної функцією виконує роль дерепресора синтезу нітрогенази. Коли концентрація амонію в клітинах різко збільшена, в його асиміляції бере участь глутаматдегідрогеназа (ДГД) - фермент, який асоційований з ЦТК і каталізує відновне амінування α-оксоглутарату (інтермедіат ЦТК) до глутамату.
Розробка прийомів активації ферментів, які беруть участь в асиміляції аміаку дозволить направлено покращувати умови засвоєння азоту мікросимбіонтом і підвищувати азотний обмін в агрофітоценозах (наприклад, акивація ферментів регуляторами росту рослин, катіонами Mn2+ та Mg2+). Крім того, подібні дослідження можуть бути основою для селекційного відбіру штамів діазатрофів з високою інтенсивністю ключових ферментів азотного обміну.
Асиміляция амония бульбочковими бактеріями:
1) HOOCCH2CH2CH(NH2)COOH NH3, ATФ↓↓—→ H2NCOCH2CH2CH(NH2)COOH
AДФ+Фн + Н2О
глутамат глутамінсинтетаза (ГС) глутамін
2) H2NCOCH2CH2CH(NH2)COOH НAД(Ф)Н2↓↓——→ НООССН2СН2СН(NН2)СООН
НAД(Ф)
глутамін глутамат
+ глутаматсинтаза (ГОГАТ)
НООССН2СН2СОСООН
α-оксоглутарат
3) НООССН2СН2СОСООН NH3, НAД(Ф)Н2↓↓——→ НООССН2СН2СН(NН2)СООН
НAД(Ф) +Н2О
α-оксоглутарат глутаматдегидрогеназа (ГДГ) глутамат
У фазу бутонізації азотфіксуюча активність кореневих бульбочок починає стрімко зростати. Найбільшу активність симбіозу виявляють у фазі цвітіння. У фазі утворення бобів активність бульбочок зменшується, а при дозріванні врожаю бульбочка вже майже не функціонує. У однорічних рослин у фазі повної стиглості бульбочки відмирають. У складі відмерлих кореневих решток вони розкладаються у грунті, а ризобії після деструкції бульбочок продовжують сапротрофне існування. У багаторічних культур симбіоз існує одночасно з вегетуючою рослиною.У грунті часто присутні неефективні бульбочкові бактерії, інфікування якими веде до низького рівня азотфіксації. Для забезпечення ефективного симбіозу доцільно насіння рослин заражати високоактивними специфічними культурами ризобій, які є основою бактеріальних добрив.
Ефективність бобово-ризобіального симбіозу визначається не тільки видовими або штамовими особливостями бульбочкових бактерій і чутливістю рослин до інокуляції. Відомо, що умови середовища і агротехніка вирощування бобових культур відіграє важливу, а нерідко вирішальну роль в реалізації потенційних можливостей ризобій і формуванні їх симбіотичних взаємовідносин з рослинами.
На ефективність бобово-ризобіального симбіозу впливають такі фактори:
Температура. Утворення бульбочок в природних умовах можна спостерігати при температурі трохи вище за 0◦С, но азотфіксація при цьому практично не відбувається. Оптимальна температура для азотфіксації та формування високого вражая бобових – 20-24 ◦С, при 30◦С молекулярний азот зв’язується у незначній кількостях.
Мінімальна вологість грунту, при якій відбувається утворення бульбочок 15-20 % від полної влагоємності, оптимальною є вологість 60-70 %;
Недолік аерації призводить до формування дрібних бульбочок і зниження азотфіксації;
РН : низькі до 4-5 та високі 9-10 пригнічують утворення бульбочок, оптимальним є нейтральне значення;
Негативно впливають на розвиток симбіотичної системи засоленість грунту, використання хімічних засобів захисту рослин від сорняків і шкідників;
Внесення мінеральних форм азоту навідь у «стартовій» дозі (30-40 кг/га) затримує утворення бульбочок і знижує нітрогеназну активність. Особливо пригнічує азотфіксацію нітрати, що пояснюється утворенням комплекса N2- леггемоглабін і зниженням процесів дихання бульбачкових бактерій. У меньшому ступені це стосується NH3. Застосування фосфорних і калійних добрив позитивно впливає на активність симбіотичного апарату.
Термін «асоціативні діазотрофи» об’єднує мікроорганізми, взаємодія яких з рослинами не призводить до формування спеціалізованих структур (типа бульбочок), проте характеризується синтезом специфічних утворень (пілей, фимбрій, адгезинів), які сприяють прикріпленню бактерій до кореней рослин, а також проникненню їх в міжклітинний простір і клітини кортекса кореня. Фімбрії і пілі – ниткоподібні клітинні придатки діаметром 3-10 нм. Вони побудовані із білкових субодиниць, що формують спіралєвидну трубчасту органелу. Наявність таких фібрилярних придатків забеспечує прикріплення мікроорганізмів до поверхні, що несе тот же заряд, що і клітинна стінка. Прикріплення клітин, необхідне для утворення плівок, здійснюється за допомогою адгезинів (полісахаридів та поверхневих білків).
Явище асоціативності детерміновано генетичним апаратом партнерів. Такими генетичними детермінантами у бактерій можуть бути гени азотного обміну, синтезу фітогормонів і других біологічно-активних речовин, гени рухловості і хемотаксиса, структурні елементи клітинної стінки і пр.
При утворенні симбіотичних і асоціативних спільнот важливу роль відіграють лектини ґрунтових бактерій і рослин. Впізнавання між лектинами і вуглеводами забезпечує специфічність мікробно-рослинних взаємодій. Лектини асоціативних азотфіксаторів беруть участь в їх прикріпленні до рослин, встановлена їх здатність впливати на різні ферментативні процеси в тканинах рослин і метаболізм ризосферних мікроорганізмів.