Біологічна фіксація молекулярного азоту - фундаментальна проблема, розробка якої необхідна для поповнення азотного фонду грунтів, підтримання та підвищення ґрунтової родючості та забезпечення населення планети екологічно чистими продуктами харчування. Рослини здатні засвоювати мінеральні сполуки азоту, вміст яких в грунті часто обмежена. Тому роль симбіотичних, асоціативних і вільноживучих азотфіксуючих мікроорганізмів, здатних переводити молекулярний азот атмосфери в засвоювану рослинами форму, виявляється вирішальною у поліпшенні живлення рослин.
Мікроорганізми, що засвоюють молекулярний азот, називаються діазотрофами. Якщо молекулярні механізми фіксації азоту різними діазотрофами схожі, то біологія самих діазотрофів дуже різна. Ріст, розвиток, взаємодія цих мікроорганізмів з рослинами і грунтом мають свої характерні риси.
Властивістю діазотрофії володіють виключно прокаріоти - представники більшості таксономічних груп бактерій і архей з різноманітними фізіологічними особливостями. Мікроорганізми, здатні фіксувати молекулярний азот, присутні практично у всіх екосистемах, оскільки мають перевагу в освоєнні різних еконіш з низьким вмістом азоту. Передбачається, що гени азотфіксації часто передаються шляхом горизонтального переносу від одного виду чи роду мікроорганізмів до іншого. Можливість такого перенесення експериментально підтверджена здійсненням кон'югаціонного перенесення nif-генів (генів азотфіксації) від Klebsiella до Escherichia. Також можливий горизонтальний перенос симбіотичних генів від одного виду ризобій іншому (наприклад, від біоагента інокулянту ендемним ризобіям інших видів).
Біологічна азотфіксація являє собою складний процес, в якому беруть участь ферменти, що відновлюють азот, а також безліч регуляторних білків, що кодуються більш, ніж 20 генами, розташованими в 7 або 8 оперонах. За трансформацію молекулярного азоту в мінеральні та органічні сполуки відповідає нітрогеназний комплекс.
Відомо чотири типи нітрогенази: класична Mo-залежна і три альтернативних - V, Fe- і супероксидзалежна.
Ферментний комплекс класичної нітрогенази складається з двох субодиниць: MoFe-білка, кодованого генами nifD і nifK, і Fе-білка, що кодується геном nifH. Останній є одним з найбільш консервативних функціональних генів, а філогенія бактерій, заснована на аналізі послідовностей цих генів, узгоджується з даними аналізу генів 16S рРНК.
Як сам фермент нітрогеназа, так і процес фіксації атмосферного азоту (N2) відрізняються високою чутливістю до молекулярного кисню. Це дозволяє зрозуміти, чому як у вільноживучих азотфіксуючих бактерій, так і в тканини бульбочок є особливі механізми, що захищають нітрогеназу від високого парціального тиску кисню.
Нітрогенази різних азотфіксаторів розрізняються молекулярною масою, вмістом металів і складаються з декількох субодиниць. Молекулярна маса (м.м.) MoFe-білка різних нітрогеназ знаходиться в межах 200-250 кДа. Фермент містить два атоми молібдену, 28-34 атома заліза і 18-24 атома сірки в одній молекулі. Молекулярна маса Fe-білка коливається від 50 до 70 кДа. Цей компонент нітрогенази містить атоми заліза й сірки.
Mo-залежна нітрогеназа - один з найбільш повільно працюючих ферментів. Тому активні діазотрофи синтезують велику кількість цього ферменту - до 20% загальної кількості білків у клітині.
Нітрогеназа є каталізатором фіксації азоту в наступній реакції:
N2 + 8Н+ + 8е- + 16 АТФ = 2 NH3 + Н2 + 16 АДФ + 16 Фн.
Нітрогеназна система має низьку субстратну специфічність, тобто має здатність відновлювати широкий спектр сполук з потрійним зв'язком, наприклад, відновлює не тільки молекулярний азот (N≡N), але і ацетилен (НС = СН), азид, закис азоту, ціанід, нітрити, ізонітріли і протони. На відновленні ацетилену заснований найбільш простий метод, що дозволяє виявити нітрогеназу. Ацетилен відновлюється тільки до етилену, який легко піддається кількісному визначенню за допомогою газової хроматографії. Всі досі досліджені азотфіксуючі мікроорганізми і симбіотичні системи здатні відновлювати ацетилен.
Більшість азотфіксуючих бактерій поряд з нітрогеназой містить і гідрогеназу (класичну), що активує Н2. Функція цієї гідрогенази полягає, мабуть, у використанні водню, що утворюється при фіксації молекулярного азоту.
Нітрогеназний комплекс, який утворює аміак з азоту повітря, діє за фізико-хімічними законами дуже економно: якщо в середовищі існування досить іонів амонію або нітратів, він припиняє роботу. Споживання рослинами аміаку, що утворився при азотфиксації або відновленні нітратів грунту, здійснюється за участю ферментів, пов'язаних з біосинтезом первинних амінокислот, насамперед глутамінової, аспарагінової кислот та їх амідів. В результаті азот у вигляді аміногруп втягується в біосинтетичні реакції метаболічних шляхів.
Біологічна азотфіксація являє собою глобальний процес, що забезпечує існування життя на нашій планеті. Так, загальна біологічна фіксація азоту на Землі становить 17,2 • 107 т на рік, що в 4 рази перевищує зв'язування N2 у формі NH3 на підприємствах хімічної промисловості. За приблизними підрахунками, для отримання сільськогосподарської продукції земної кулі потрібно щорічно близько 100-110 млн тон азоту. З мінеральними добривами вноситься лише близько 30% необхідної її кількості. Значна частина потреби може бути заповнена за рахунок симбіотичної азотфіксації, продуктивність якої становить 100-400 кг N / га в рік.
У симбіотичній фіксації азоту повітря беруть участь макросимбіонт - рослина-господар і мікросимбіонт - бульбочкові бактерії родин Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae і Hyphomicrobiaceae. Систематика бульбочкових бактерій довгий час базувалася на специфічності, що проявляється по відношенню до різних видів бобових рослин-господарів. Застосування сучасних методів таксономії (геносистематики, нумеричний аналіз) показало, що систематика різобій, заснована на філогенетичній спорідненості між різними їх групами, не завжди збігається з традиційною систематикою. Бульбочкові бактерії ділять на шість родів: до родини Rhizobiaceae відносять роди Rhizobium, Allorhizobium, Sinorhizobium; до родини Phyllobacteriaceae відносять рід Mesorhizobium; до родини Bradyrhizobiaceae відносять рід Bradyrhizobium; і до родини Hyphomicrobiaceae відносять рід Azorhizobium.
Дані роди належать до а-підгрупи протеобактерий, але розрізняються за культурально-біохімічними ознаками та складом ДНК, що вказує на поліфілогенетичне походження ризобій. Багато вчених вважають, що їх дивергенція від «загального пращура» сталася задовго до появи бобових рослин. Так як останні утворилися в пізньому крейдяному або ранньому третинному періоді, то, мабуть, бобові рослини-господарі і зіграли основну роль у виникненні бобово- ризобіального симбіозу. Ризобії утворюють бульби на коренях рослин родини бобових більш ніж 112 родів.
На поживних середовищах бульбочкові бактерії різних видів бобових рослин ростуть з різною швидкістю. До швидкоростучих відносяться бульбочкові бактерії гороху, конюшини, люцерни, кормових бобів, вики, сочевиці, чини, буркуну, квасолі, нуту до повільноростучих - бульбочкові бактерії люпину, сої, арахісу. Цілком сформовані колонії швидкоростучих культур можна отримати на 3-4-ту добу інкубації, колонії повільноростучих - на 7-8-у.
Для позначення виду бульбочкових бактерій прийнято до родової назви додавати термін, відповідний латинській назві того виду рослини, з клубеньков якого вони виділені і на якому можуть утворювати бульби. Наприклад, Rhizobium leguminosarum biovar trifolii - бульбочкові бактерії конюшини, Rhizobium lupini - бульбочкові бактерії люпину.
Для бульбочкових бактерій характерна різноманітність форм - поліморфність. Вони можуть бути паличкоподібними, овальними; серед цих бактерій зустрічаються також L-форми, кокові нерухомі і рухомі організми. Молоді бульбочкові бактерії в чистій культурі на поживних середовищах зазвичай мають паличкоподібну форму розміром 0,5-0,9 х 1,2-3 мкм, рухливі, розмножуються поділом У паличкоподібних клітин бульбочкових бактерій конюшини спостерігається поділ перешнуруванням. З віком паличкоподібні клітини можуть переходити до брунькування. За Грамом клітини фарбуютьсянегативно, ультратонка структура їх типова для грамнегативних бактерій. При старінні бульбочкові бактерії втрачають рухливість і переходять у стан «оперезаних» паличок. Смугастість клітин добре виявляється при перегляді в світловому мікроскопі після обробки клітин аніліновими барвниками, так як щільні ділянки протоплазми (пояски) забарвлюються гірше, ніж проміжки між ними. У люмінесцентному мікроскопі пояски, що розташовуються в середині клітини або на кінцях, світло- зелені, проміжки між ними не світяться і виглядають темними. З віком бактеріальна клітина наповнюється жировими включеннями, які не сприймають забарвлення; внаслідок цього і спостерігається смугастість клітини. Стадія «оперезаних паличок» передує стадії формування бактероїдів - клітин неправильної форми: потовщених, розгалужених, сферичних, груше- і колбовидних. Термін «бактероїди» ввів в літературу Дж. Брунхорст в 1885 р, застосувавши його до незвичайних за формою утворенням у бульбачках, значно більшим, ніж паличкоподібні клітини бактерій.
Бактероїди містять більшу кількість волютинових гранул і характеризуються більш високим вмістом глікогену і жиру, ніж паличкоподібні клітини. Бактероїди, вирощені на штучному живильному середовищі і ті, що утворилися в тканинах бульби, фізіологічно однотипні. Є думка, що бактероїди - це форми бактерій з незавершеним процесом поділу. При незавершеному діленні клітин бульбочкових бактерій виникають дихотомічно розгалужені форми бактероїдів. Кількість бактероїдів збільшується при старінні культури; їх появі сприяють виснаження живильного середовища, накопичення продуктів обміну, внесення в середовище алкалоїдів.
Колонії швидкоростучих бульбочкових бактерій мають колір топленого молока, часто напівпрозорі, слизові, з рівними краями, помірно опуклі, з часом розростаються на поверхні агаризованого середовища. Колонії повільноростучих бактерій більш опуклі, дрібні, сухі, щільні і, як правило, не розростаються на поверхні середовища. Слиз, що виробляється бульбочковими бактеріями, являє собою комплексну сполуку полісахаридного типу, до складу якого входять гексози, пентози і уронові кислоти.
Бульбочкові бактерії - мікроаерофіли – ростуть в аеробних умовах, але можуть розвиватися і при незначному вмісті кисню в середовищі.
Як джерело вуглецю в поживних середовищах бульбочкові бактерії використовують вуглеводи і органічні кислоти; як джерело азоту - різноманітні мінеральні та органічні азотовмісні сполуки. При культивуванні на середовищах з високим вмістом азотовмісних сполук ризобії можуть втратити здатність проникати в рослину і утворювати бульби; тому зазвичай бульбочкові бактерії вирощують на рослинному екстракті (наприклад, квасоляному або гороховому відварі) або грунтовій витяжці. Необхідний для розвитку фосфор вони можуть отримувати з мінеральних і органічних фосфоровмісних сполук; джерелом кальцію, калію та інших елементів можуть служити мінеральні сполуки.
Багато видів бульбочкових бактерій здатні синтезувати вітаміни групи В, а також ростові речовини. Бульбочкові бактерії синтезують З-индолил-З-оцтову кислоту (ІУК), цитокініни, гібереліни і гіббереллоподібні речовини, які беруть участь у процесах розвитку рослин та утворенні симбіотичних зв'язків між партнерами ще до утворення на корінні бульб.
Всі бульбочкові бактерії приблизно однаково стійкі до лужної реакції середовища (pH 8,0), але неоднаково чутливі до кислої.
Симбіотичні властивості ризобій характеризуються такими визначеннями, як специфічність, вірулентність, активність, конкурентоспроможність та ефективність.
Кожен вид бульбочкових бактерій пристосований до одного виду рослини або до групи видів рослин. Ця пристосованість бульбочкових бактерій до групи видів або певного виду бобової рослини називається специфічністю. Специфічність бульбочкових бактерій може бути вузькою та широкою. При вузькій специфічності ризобії заражають рослини одного виду або навіть сорту. Наприклад, бульбочкові бактерії конюшини заражають тільки групу конюшини - видова специфічність, а бульбочкові бактерії люпину можуть характеризуватися навіть сортовою специфічністю - заражати тільки алкалоїдні або безалкалоїдний сорти люпину. За широкої специфічності ризобії, наприклад гороху, можуть заражати рослини гороху, чини, бобів, а бульбочкові бактерії чини і бобів можуть заражати рослини гороху, тобто усі вони характеризуються здатністю «перехресного зараження».
Не всі штами одного специфічного виду бульбочкових бактерій можуть однаково успішно проникати в коріння рослини. Деякі штами відрізняються високою проникаючою здатністю і утворюють на коренях бобової рослини багато бульбочок, інші важче проникають в корені і утворюють менше бульбочок. Отже, штам бульбочкових бактерій повинен бути не тільки специфічним, але й вірулентним. Під вірулентністю мається на увазі здатність бульбочкових бактерій проникати в тканину кореня, розмножуватися там і викликати утворення бульбочок. Якщо специфічністю визначається спектр дії бактерій, то вірулентністю бульбочкових бактерій характеризується активність їх дії в межах даного спектра.
Деякі специфічні вірулентні штами в симбіозі з рослиною-господарем інтенсивно фіксують азот повітря, в у інших штамів фіксація азоту протікає повільніше і в меншому обсязі. Здатність штаму ініціювати високу інтенсивність симбіотичної асиміляції азоту називають активністю штаму. Залежно від того, якою мірою бульбочкові бактерії сприяють підвищенню врожайності бобових культур, їх прийнято ділити на активні (ефективні), малоактивні (малоефективні) і неактивні (неефективні) штами. Активність бульбочкових бактерій не є їхньою постійною властивістю. Нерідко в лабораторній практиці спостерігається втрата культурами бульбочкових бактерій активності. Зниження активності бульбочкових бактерій відбувається в присутності деяких антибіотиків, амінокислот. Однією з причин втрати активності бульбочкових бактерій може бути вплив фага.
У грунті в присутності інших штамів не завжди вірулентний штам буде першим інфікувати рослину. У цьому випадку слід враховувати його конкурентну спроможність, яка нерідко маскує властивість вірулентності в природних умовах.
Необхідно, щоб вірулентні штами володіли і конкурентоспроможністю, тобто могли успішно конкурувати не тільки з представниками місцевої сапрофітної мікрофлори, а й з іншими штамами бульбочкових бактерій. Показником конкурентоспроможності штаму служить кількість утворених ним бульбочок у відсотках від загального числа бульбочок на коренях рослин. Неактивний для однієї рослини-господаря штам ризобій в симбіозі з іншим видом бобової рослини може бути цілком ефективним. Тому при характеристиці штаму з точки зору його ефективності слід завжди вказувати, щодо якого виду рослини-господаря виявляється його дію.
Специфічність, вірулентність, конкурентоспроможність і активність штаму ризобій є основними умовами формування ефективного симбіозу. Якщо бобову культуру вирощують в регіоні традиційно або вона зустрічається в природних фітоценозах, то в грунті є аборигенні специфічні штами ризобій, здатні інфікувати ці культури. Додаткова інокуляція в такому випадку, як правило, не покращує утворення бульбочок і суттєво не збільшує кількість фіксованого азоту повітря. Якщо ж культуру в даному районі обробляють вперше (наприклад, люпин, сою), то в грунті немає «місцевих» специфічних бульбочкових бактерій, тому перед посівом обов'язково слід проводити інокуляцію, інакше бульби на коренях не утворюються, рослини не будуть використовувати азот повітря, виникне азотна недостатність і сформується низький урожай.
У формуванні симбіозу можливо виділити кілька основних етапів: передінфекцію, інфекцію і розвиток бульбочки, функціонування бульбочки.
Передінфекційний сигналлінг між бульбочковими бактеріями і рослинами
Перший етап - передінфекція, в ході якої ризобії вступають в контакт з бобовою рослиною, і відбуваються специфічні реакції впізнавання.
Структурно-фізіологічні зміни, що відбуваються при формуванні бобово-ризобіального симбіозу, стають можливими завдяки сигналінгу, в процесі якого молекулярні сигнали продукуються як бактеріями, так і рослинами-хазяїнами. Сигналінг - процес послідовного вироблення партнерами по симбіозу сполук, здатних індукувати проходження наступних стадій взаємодії.
Взаємодія бобових рослин з різними штамами бактерій є специфічною, базується на інтеграції генетичних систем партнерів і значною мірою залежить від властивостей бульбочкових.
У передінфекційній стадії важливим є рух бульбочкових бактерій до кореневих волосків. У складі ексудатів рослин є сигнальні молекули, що поліпшують адгезію і прискорюють ініціацію нодуляціі (процесу проникнення ризобій у клітину рослини). Встановлено, що бульбочкові бактерії мають позитивний хемотаксис до таких органічних речовин, як амінокислоти, вуглеводи, органічні кислоти, що знаходяться у насінні та кореневих виділеннях бобових рослин. Виявлений зв'язок між хемотаксисною активністю і конкурентоздатністю бульбочкових бактерій. З другого боку, рослина повинна контролювати розвиток бактерій і забезпечувати захист від надмірного розмноження ризобій, а також фітопатогенів. Тому ексудати рослин містять речовини, які пригнічують розвиток бульбочкових бактерій. За хімічною будовою це різноманітні сполуки: антибіотики, глікозиди на основі таніну, а також похідні фенолів. Наявність цих речовин значною мірою зумовлює видову і сортову чутливість рослин до бактеризації. Збалансованість екстрактивних речовин позитивної і негативної дії на ризобії значною мірою сприяє комплементарності мікро- і макросимбіонтів.
Зовнішні шари клітинної оболонки бульбочкових бактерій сформовані екзополісахаридами (ЕПС). Згідно з даними літератури, ЕПС ризобій мають велике значення в процесах нодуляціі. ЕПС можуть виконувати різні функції: специфічну (сигнальну) і неспецифічну, яка не залежить від структури і пов'язана з прикріпленням бактеріальної клітини до кореня рослини або з формуванням структури бульбачок.
Молекулярні механізми формування азотфіксуючих мікробно-рослинних систем включають функціонування лектинів - сполук білкової природи з аглютинативними властивостями. Лектини - це білки неімунного походження, які здатні оборотно і вибірково зв'язувати вуглеводи, не викликаючи їх хімічного перетворення. Вони можуть взаємодіяти як з моно-, так і з олігосахаридами, із залишками вуглеводів, складних органічних речовин - глікопротеїдів, полісахаридів і глікозидів, а також здатні аглютинувати клітини. Цей феномен пояснюється тим, що лектини подібно антитілам в більшості випадків є багатовалентними лігандами, і в складі їх молекули знаходяться, як правило, два або чотири центри зв'язування вуглеводів. Однак, якщо антитіла здатні розпізнавати тільки детермінанти антигенів, які викликали їх появу і мають унікальну структуру, то лектини розпізнають певні вуглеводні залишки незалежно від того, до складу якої молекули вони входять. Число вуглеводзв’зуючих доменів визначає валентність лектину. Слід зазначити, що лектини часто розпізнають одночасно кілька моносахаридів; відмінності виявляються тільки в ступені спорідненості лектина до того чи іншого вуглеводу.