Использование люминесцентной микроскопии в падающем свете дает возможность изучать прижизненно окрашенные почвенные микроорганизмы непосредственно на поверхности почвенных монолитов, агрегатов, структурных отдельностей, корней и т. д. (Звягинцев, 1963). Во многих отношениях метод дает возможность наиболее близко подойти к рассмотрению микроорганизмов и их ассоциаций в естественных условиях.
Приготовляют формочку из нержавеющей стали, пластмассы или стекла. Формочка должна иметь острые края (рис. 5, а).Расчищают поверхность почвы и вдавливают в нее формочку. Формочку можно вдавливать и в любой горизонт почвы, используя для этого обычный почвенный разрез. Расчищают почву, находящуюся по бокам от формочки, и осторожно вынимают ее так, чтобы над краями формочки возвышался слой почвы. Затем острой бритвой срезают лишнюю почву. При этом верхняя граньмонолита должна оказаться на уровне краев формочки. На поверхность почвы помещают каплю раствора акридина оранжевого и накрывают ее очень тонким покровным стеклом. Через 10—20 мин формочку помещают на предметный столик люминесцентного микроскопа и рассматривают почву, применяя иммерсионный объектив. Так как свет подается через объектив, величина монолита принципиального значения не имеет — он может быть большим. Можно рассматривать монолит и без покровного стекла при малых увеличениях. Микроорганизмы на хорошо приготовленных препаратах видны и в этом случае. Часто полезно рассмотреть не срез, а естественный излом монолита или грань структурной отдельности, а также срезы через почвенные агрегаты.
При помощи описываемого метода удается рассмотреть и микрофлору ризосферы. Вынимают корень растения из почвы (толщина корня не имеет значения), окрашивают его акридином оранжевым и помещают на столик микроскопа. Удается хорошо видеть клетки, прикрепившиеся к поверхности корня, корневых волосков и частиц почвы, приставших к корню. При окрашивании акридином клетки корня обладают зеленым свечением, как и микроорганизмы, однако они имеют другой оттенок зеленого свечения и хорошо видны на фоне клеток корня и корневых волосков. Можно поместить монолит почвы с проходящими через него корнями в формочку (рис. 5), сделать срез, который пересекал бы корень, и рассматривать микрофлору ризосферы.
В лабораторных условиях микрофлору корней изучают следующим образом. Берут небольшой стеклянный цилиндр, дно которого делается съемным. Под него: подстилают одно или несколько покровных стекол. В сосуд насыпают почву и высевают семена какого-либо растения (рис. 5, б). Корни стелются по стеклу. Дно снимают, под покровное стекло сбоку подают краситель, сосуд вверх дном помещают под микроскоп и изучают микрофлору.
Методы, выделений грибов из почвенной взвеси на твердые питательные среды не дают представления о том, какие виды находились в почве в виде спор, а какие в виде мицелия, а метод прямого микроскопирования не позволяет дифференцировать эти организмы по видам. Для определения видов грибов, находящихся в почве в виде мицелия, существует несколько методов. Наиболее приемлемыми, дающими наилучшие результаты, являются методы Торнтона и Честерса.
МЕТОД ЭКРАНИЗИРОВАННЫХ СТЕКОЛ ТОРНТОНА
Приготовляют специальную камеру, сделанную из стекла и представляющую собой прямоугольник (рис. 6). Камера имеет размеры 10X4 см. Сверху камера покрывается прямоугольным стеклом-экраном, толщиной 1 мм, который имеет 10 отверстий диаметром 5 мм. Внутрь камеры на дно помещают стекло, которое плотно прилегает к стенкам камеры. В таком виде камеру стерилизуют. После стерилизации на стекло наливают 8 мл водного агара и отверстия закрывают стерильными покровными стеклами. Всю камеру помещают в почву либо в вертикальном, либо, в горизонтальном положении. Через 7—10 суток камеру извлекают из почвы, стекла с агаром, находящиеся внутри камеры, вынимают и просматривают под бинокуляром или лупой. Из обнаруженных колоний производят выделение грибов в чистую культуру.
Метод рассчитан на то, что через отверстия в стекле-экране проникнут только формы, находящиеся в почве в состоянии активного мицелия.
Из прочного стекла изготовляют специальные стеклянные трубки, подобные пробиркам. Диаметр их может быть различным. Каждая трубка в нижней половине имеет несколько отверстий по 0,5 мм в диаметре. Имеется 3 типа трубок (рис. 7).
Трубка длиной 15 см и шириной 2 см с 9-ю отверстиями, расположенными по спирали в нижней части трубки. Отверстия делают так, чтобы их края были вровень со стенками трубки.
Трубка такого же размера, как и первая, с 6-ю наружными отверстиями, которые ведут к конусообразным внутренним капиллярам длиной 2 мм.
Трубка длиной 10 см и шириной 2,5 см. Конец трубки конусовидный и выдувается в виде луковицы. Он имеет 3 или 4 отверстия, расположенные на одном уровне.
Трубки стерилизуют и наполняют стерильной охлажденной до 50° питательной средой. Среда наливается до верхнего капилляра. Затем трубки вставляют в другие стерильные трубки большего диаметра (контейнеры) и в таком виде доставляют в поле (рис. 7, Д Е). Внутренние трубки вынимают и помещают в почву на нужную глубину и оставляют на 7—14 сут. Затем трубки вынимают и в новом контейнере доставляют в лабораторию. Содержимое трубок извлекают стерильной иглой, помещают его в стерильную чашку Петри в колонии, выросшие против капилляров, отсевают на свежую питательную среду. Метод рассчитан на то, что через капилляры в стенках трубки проникает только активно растущий мицелий.
Мюллер и Дюрель предложили более простую модификацию этого метода. Вместо стеклянных трубок, требующих специального выдувания, используют центрифужные пробирки из пластика. С помощью трафарета в них по спирали проделывают отверстия шириной 5 мм, расстояния между отверстиями могут варьировать. Пробирки обматывают изоляционной лентой и наполняют питательным агаром до высоты4 см, закрывают ватной пробкой и стерилизуют автоклавированием. Перед помещением в почву с помощью большой иглы, прокаленной на спиртовке, протыкают изоляционную ленту. Это делает возможным проникновение в пробирки активно растущего мицелия. После 4-6-суточной экспозиции в почве трубки вынимают и переносят в лабораторию. В лаборатории ленту разматывают и по мере разматывания каждого отверстия переносят участки агара, расположенного против отверстий, на чашки Петри со средой для культивирования грибов. Метод проще, чем предыдущий, и дает большую гарантию от загрязнения.
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), представляет собой молекулярно-биологический метод, в котором олигонуклеотидный зонд, меченный флуоресцентным веществом, проникает в клетки бактерий. В случае если рибосомные нуклеиновые кислоты (рРНК) имеют подходящую последовательность по отношению к зонду, узнаваемую как мишень, то этот зонд будет присоединяться к своей мишени и не будет удаляться на последующем этапе промывания. Бактерии, в которых зафиксировался зонд, затем будут излучать флуоресцентный сигнал. Метод можно использовать для исследования структуры бактериальных сообществ.
На первом этапе происходит конструирование зондов. Обычно зонды содержат от 15 до 30 оснований по длине в виде участков одноцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислот и направлены на специфический участок-мишень в микроорганизме.
Клетки фиксируют (водными растворами спиртов или альдегидов) на субстрате, как правило, на предметном стекле. В процедуре FISH затем применяется процедура гибридизации путем применения гибридизационного буфера, содержащего, один или несколько флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, содержащие олигонуклеотид с прикрепленным флуоресцентным маркером. Этот олигонуклеотид способен нацеливаться на специфическую последовательность в клетке бактерии (в 16S рРНК). Понятно, что присоединение означает образование водородных связей между комплементарными участками нуклеиновой кислоты. В FISH методике олигонуклеотидные зонды являются комплементарными и способны связываться с определенным участком рибосомной последовательности-мишени в микроорганизме. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.
Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.
В данном случае использовали 3 16S рРНК зонда: 1) EUB338 проба связывает высоко консервативные области в 16S рРНК бактерии и является специфической для домена (надцарства) бактерий. Также использовали зонды, специфические 2 клостридиальным кластерам: 2) Clost XIYa и 3) Clost XIYa -с. С 5’ конца пробы помечались флюоресцентными красителями Cy3, Cy5 или изотиоцианатом флуоресцеина (FITC). Наложение 1) и 2) проб дали розовое свечение, 1) и 3) – бирюзовое. Белое свечение дала гибридизация с обеими группоцпецифическими пробами (менее 1% , выявленных клеток пробой 1).
Для исследования функционирования микроорганизмов с растениями применяют меченные репортерным геном бактерии. По цвету продукта репортерного гена, находящегося под промотором исследуемого гена, отвечающего за определенную функцию, можно наблюдать in situ за физиологической активностью меченных бактерий. Так, на фото мы можем видеть корень риса, колонизированный меченными gusA-геном бактериями Klebsiella oxytoca. Визуализация бактерий достигается благодаря конвертированию ими безцветного субстрата для бета-глюкуронидазы в субстанцию голубого цвета.
А- меченные бактерии находятся в центральных сосудах корня риса.
Б – меченные бактерии экспрессируют в растении ген азотфиксации, соединенный с репортерным геном gusA. Таким образом, метка позволила выявить механизм колонизации бактериями растений и показать активность азотфиксации в корнях риса.