Почвенную микробиологию следовало бы рассматривать как самостоятельную дисциплину, т.к. она подходит к изучению почвенных явлений с совершенно особых позиций с использованием собственных методов. Основной особенностью микробиологического анализа почвы является его экологическая направленность: он должен обеспечить сохранение существующих между микроорганизмами взаимоотношений, как синергических, так и антагонистических. Значительно сложнее изучать поведение различных групп микроорганизмов, находящихся в динамическом взаимодействии друг с другом, чем поведение определенных видов в чистых культурах. Эта экологическая направленность почвенной микробиологии заставляет применять очень специальные методы; методы обычной микробиологии, основанные на изучении свойств чистых культур в данном случае непригодны.
Общую активность почвы можно оценивать по выделению углекислоты. Важно при использовании этого метода соблюдать строго определенные условия на протяжении всего опыта (постоянная температура, влажность, аэрация), что затрудняет проведения как в поле, так и в лаборатории. Выделение углекислоты можно оценивать, используя газометрическую методику Варбурга. Необходимо подчеркнуть, что даже в оптимальных условиях количественное определение выделившейся углекислоты дает представление лишь относительно общего результата этого процесса и не позволяет получить никаких сведений о его механизме.
Прямые микроскопические методы дают возможность определять общее количество отдельных групп микроорганизмов. Однако даже и при применении прямых микроскопических методов можно подсчитать только количество бактерий. Особые микроскопические методы необходимо применять для подсчета грибов и совершенно специфические — для подсчета почвенных водорослей и беспозвоночных животных. Таким образом, когда определяется общее количество микроорганизмов в почве (точнее было бы говорить об определении общего количества бактерий), то из полученных данных можно определить только- биомассу бактерий, а не общую биомассу почвенных микроорганизмов.
Следует учитывать, что общее количество микроорганизмов (и их биомасса) характеризует только потенциальный запас микроорганизмов в почве, но эти цифры еще не говорят о том, какая часть микроорганизмов находится в активном, а какая часть в покоящемся состоянии.
Для получения более полной информации нельзя ограничиваться определением количества микроорганизмов и их биомассы на 1 г почвы, но необходимо проводить пересчет количества микроорганизмов на единицу поверхности почвы с учетом количества микроорганизмов по всему почвенному профилю, расчета содержания микроорганизмов в столбике почвы с площадью поверхности в 1 см2 (определения количества микроорганизмов на единицу поверхности почвы).
Общее содержание микроорганизмов — величина консервативная и малоподвижная, поэтому определение его мало пригодно для установления влияния различных факторов на микрофлору почв (например, влияния пестицидов, удобрений и т. д.).
Прямые методы определяют в 1000 раз больше бактерий, чем посев на питательные, даже малоэлективные среды.
Часто для прямого микроскопического изучения почвы применяют метод С. Н. Виноградского, причем обычно пользуются модификацией этого метода, предложенной О. Г. Шульгиной. Тщательно отобранную среднюю пробу почвы массой в 5 г помещают в 250-миллилитровую колбу, содержащую 45 мл воды. Вода не должна содержать клеток микроорганизмов. По оригинальной прописи колбу энергично встряхивают 5 мин. Рекомендуется для более полного учета числа бактерий обрабатывать почвенную суспензию ультразвуком или при отсутствии ультразвуковой устновки на микроизмельчителе тканей. В течение нескольких секунд дают осесть наиболее крупным почвенным частицам и затем пипеткой, с точно вымеренной величиной капли, наносят одну каплю на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. Одновременно с каплей суспензии на стекло наносят каплю 0,1%-ного очищенного от микробных клеток агара. На стекле, на которое наносят суспензию, предварительно отмечают прямоугольник площадью в 8 см2, ширина которого равна ширине стекла. Нанесенную взвесь при помощи покровного стекла помешивают и равномерно распределяют по поверхности всего прямоугольника. Препарат подсушивают и фиксируют над пламенем горелки или 96 % спиртом, окрашивают карболовым эритрозином (окрашивание длительное от 1 ч до суток). Краску смывают, последовательно погружая стекла в 4—5 стаканов с водой. Препараты высушивают и помещают под микроскоп (масляная иммерсия, 90Х).
Расчет количества клеток в 1 г воздушно-сухой или абсолютно сухой почвы проводят по формуле
А • 8 • 109 • (Р+ 100)
Б • В • Г
где А — общее количество учтенных на стекле клеток; Б — площадь поля зрения (мкм2), определяется при помощи объект- микрометра; В — объем нанесенной суспензии (мл); Г — количество просчитанных полей зрения; Р — влажность почвы (%).
После проведения количественного учета микроорганизмов следует вычислить величину биомассы микроорганизмов в почве. Для этого нужно знать среднюю величину клетки микроорганизмов, которую можно получать после измерения под микроскопом размеров клеток, встречающихся в данной почве. Затем количество клеток в 1 г почвы умножается на средний объем клетки и на их удельный вес (1,10 г/см3). Часто делают пересчет биомассы микроорганизмов в т/га. Вычисляют вес живых клеток и вес сухих клеток.
Одним из наиболее совершенных методов выявления, изучения и количественного учета микроорганизмов в их естественной среде обитания является люминесцентная микроскопия в падающем свете. Метод сводится к тому, что приготовленные из почвенной суспензии препараты окрашиваются специальным красителем (флуорохромом) акридином оранжевым (1:10000, 2-4 мин). При использовании данного метода достигается более уверенный подсчет бактерий в почве по сравнению с методом Виноградского. Яркие зеленые клетки хорошо заметны на темном или красном фоне почвенных частиц и препарата, причем микроскопия в отраженном свете позволяет учитывать и адсорбированные клетки, которые, как правило, не видны в проходящем свете (метод Виноградского).
Предложено несколько вариантов методов люминесцентной микроскопии для количественного учета почвенных микроорганизмов: от окрашивания почвенной суспензии с подсчетом микроорганизмов в специальных камерах или в капиллярах Перфильева до окрашивания фиксированных препаратов. Окрашивание готовых препаратов является наилучшей модификацией метода (метод Звягинцева и Кожевина). В этом случае отпадает необходимость в предварительном подборе оптимальной концентрации флуорохрома для каждой почвы, и не требуется специальной камеры для количественного подсчета. К тому же препараты до окрашивания и подсчета могут достаточно долго храниться, что позволяет проводить подсчет не по ходу опыта, а в удобное для исследователя время. Препарат из почвенной суспензии готовят аналогично предыдущему методу, но на площади 4 см2, наносят 0,01 мл.
Количество микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы, вычисляют по формуле
М = 4•а•н • 1010,
р
где М — количество клеток в 1 г почвы, а — среднее число клеток в поле зрения, р — площадь поля зрения (мкм2), н — показатель разведения.
Для подсчета рекомендуется из каждого почвенного образца готовить два препарата и на каждом препарате подсчитывать клетки в пяти полях зрения.
Современные электронные микроскопы с разрешением'2—5 А позволяют отличить мельчайшие микроорганизмы в почвенной суспензии и определить их численность (Никитин, Макарьева, 1970). Работы Д. И. Никитина показали, что в почвах содержится множество новых форм микроорганизмов, которые не определяются с помощью других методов. При применении методов предварительного диспергирования почвы и десорбций микроорганизмов с помощью электронной микроскопии удается подсчитать наибольшее ко сравнению с другими методами количество микробов.
Диспергированную почвенную суспензию помещают в стерильный мешочек из синтетического полупроницаемого материала и подвергают диализу в стерильной дистиллированной воде в течение 3—12 ч. После диализа взвесь в количестве 3-8 мкл наносят стерильной микропипеткой на пленки-подложки для электронного микроскопа. После высыхания капель препараты оттеняют металлом (хромом или окисью вольфрама) и просматривают в электронном микроскопе. Для получения достоверных данных необходима вариационно-статистическая обработка материала, позволяющая установить ошибку средней арифметической, разброс рассчитанных величин, точность и надежность опыта.
Для выделения и учета отдельных групп микроорганизмов приходится применять особые, часто специальные, приемы, методы и питательные среды. Они различаются в зависимости от биологических особенностей выделяемых микроорганизмов (автотрофы или гетеротрофы, аэробы и т.д.). Невозможно создать универсальную питательную среду, на которой бы развивались все почвенные микроорганизмы. При количественном учете микроорганизмов почвы желательно выделить по возможности более широкий круг микроорганизмов. Подбирают среды более универсальные — агаризированную воду, агаризованные почвы или почвенные вытяжки. На таких средах развивается большее количество микробов, чем на средах, богатых органическими веществами и элементами зольного питания. Однако какая среда не была бы применена, на ней удается учесть только незначительную часть (0,1 — 1%) микронаселения почвы. В литературе для обозначения микроорганизмов, выделяющихся на этих более универсальных средах (агаризованные почвенные вытяжки, среда Чапека для бактерий и актиномицетов, среда Эшби для олигонитрофильных микроорганизмов, МПА для бактерий), часто применяется термин «учет общей микрофлоры почвы». В действительности только прямые микроскопические методы дают истинное представление о количестве микробов в почве. Все методы выделения на питательные среды позволяют учесть только довольно ограниченную группу микроорганизмов.
В большинстве случаев для изучения и учета почвенных микроорганизмов проводится поверхностный посев 10-кратных разведений почвенной суспензии на чашки Петри с различными средами. При этом удается использовать один этот метод для изучения разных групп микроорганизмов — бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей.
Помимо учета общего количества микроорганизмов на питательных средах часто ставится задача изучения более узких групп микроорганизмов, называемых физиологическими группами. Это микроорганизмы, связанные с определенным этапом превращения органических или неорганических веществ. Например, определенные группы микроорганизмов, связанные с отдельными стадиями превращения азота: азотфиксаторы, нитрификаторы, аммонификаторы, денитрификаторы. Большое значение имеет изучение деллюлозоразлагающих микроорганизмов, микроорганизмов, способных использовать труднодоступные для растений соединения фосфора, а также участвующих в определенных этапах превращений серы, железа, марганца и т. д. Для учета определенных физиологических групп (фиксаторов азота, нитрификаторов, аэробного разрушение клетчатки) плотную селективную среду засевают комочками почвы по Виноградскому. Колонии образуются только вокруг тех комочков, которые содержат микробы изучаемой группы, и об активности процесса в почве судят по проценту таких комочков. Эта методика дает очень неточные результаты: разная величина комочков, не смотря разное количество микробов в комочке (при условии если «порог», необходимый для размножения микробов достигнут) считают, что выросла одна колония вокруг комочка.
Метод предельных разведений предполагает засев десятикратных разведений в пробирки с жидкими селективными средами. После инкубации в термостате устанавливают последнее разведение, в котором еще обнаружен рост (для точности используют 3-5 параллельных пробирок). В качестве теста используют также исчезновение субстрата или образование продукта (исчезновение тирозина и появления аммиака при изучении процесса аммонификации). Для расчета количества микробов используют таблицы Мак-Креди.
При работе в строго определенных и всегда одинаковых условиях применение разработанных методов позволяет получить правильное представление о биологическом состоянии почвы и сравнивать в этом отношении почвы между собой. Основные условия, которые для этого надо соблюдать:
Гомогенизация многочисленных проб почвы и проведения анализа возможно скорее после взятия проб. Наименьший вред приносит хранение почвы в холодильнике (медленное высыхание почвы).
Проводить все анализы при помощи методик, основывающихся на одном и том же принципе.
Учитывать скорость реакции (производить многочисленные анализы через определенные интервалы времени и выражать результаты в виде кривой).
Всегда работать в одинаковых и строго определенных условиях.
Ценность и даже значение микробиологического анализа почвы заключается в получении не абсолютных, а в основном сравнительных данных (различных горизонтов, ризосферы и контрольной почвы, почв, принадлежащих к одному и тому же или близким типам).
Методы изучений микробных ассоциаций и взаимоотношений между микроорганизмами и растениями непосредственно в почве
Методы прямого микроскопического подсчета не дают возможности составить представление о естественном распределении микробов, об ассоциациях почвенных микроорганизмов в естественных условиях. При использовании этих методов почвенные микробы оказываются перемешанными в процессе приготовления почвенной суспензии. Существуют специальные методы, которые позволяют судить о естественном распределении микроорганизмов в почве.
МЕТОД СТЕКОЛ ОБРАСТАНИЯ ХОЛОДНОГО
Метод Холодного и его модификации широко применяются в почвенной микробиологии. С их помощью были получены интересные материалы о почвенных микробных ассоциациях, открыты новые формы микроорганизмов, изучены микроорганизмы разных почв и т. д.
В почву вносятся предметные стекла, поверхность которых вскоре покрывается почвенными коллоидами, где микроорганизмы развиваются в условиях, близких к естественным. Поверхность стекла, конечно, не может полностью имитировать поверхность почвенных частиц, на которых в действительности развиваются почвенные микроорганизмы. В связи с этим делались неоднократные попытки заменить стекло другими материалами (нейлоновая ткань, полиэтилен), но пока это не получило большого распространения.
Перед закладкой в почву предметные стекла тщательно очищают, выдерживая их в концентрированной серной кислоте, и отмывают в 1%-ном растворе соды и в дистиллированной воде.
На поверхности почвы делают разрез ножом и в него вертикально вставляют предметное стекло. Необходимо по возможности сохранить естественное сложение почвы и, зарывая стекло, стремиться создать такую же плотность почвы, какая была до постановки опыта. Стекла закапывают так, чтобы их верхний край был не ближе чем на 1—3 см от поверхности почвы. Всегда ставят несколько параллельных стекол. Места нахождения стекол тщательно отмечают. В почве стекла экспонируют месяц и более.
По истечении срока экспозиции стекла извлекают так, чтобы не повредить микробные ассоциации на той стороне стекла, которая будет подвергаться микроскопированию. Нельзя допускать скользящего движения стекла по почве, так как при этом развившиеся на стекле микроорганизмы могут счищаться. Нижнюю сторону стекла тщательно протирают, а верхнюю подсушивают на воздухе, фиксируя на пламени горелки или в парах осмия, и помещают в стакан с водой, чтобы отделить от стекла крупные почвенные частицы, которые мешали бы дальнейшему исследованию. После промывки препарат красят карболовым эритрозином и просматривают под микроскопом.
Из вариантов метода Холодного наибольшее распространение получила модификация А. В. Рыбалкиной и Е. В. Кононенко (1957). В этом случае перед закладыванием стекол в почву на их поверхность наносят слой крахмало-аммиачного агара. Микроорганизмы развиваются быстрее и лучше, но внесенное на стекло органическое вещество создает специфические условия для развития микроорганизмов.
Хорошие результаты получаются при изучении стекол обрастания при помощи люминесцентной микроскопии. Стекла окрашиваются водным раствором акридина оранжевого (1 : 10 000) . Клетки микробов в этом случае по сравнению с окрашиванием эритрозином видны более четко, кроме того, видны клетки, расположенные на поверхности почвенных частиц, прилипших к стеклу.
Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе (1961) сконструировали специальный капиллярный прибор-педоскоп, который служит для изучения почвенных микроорганизмов и их ассоциаций. При использовании этого прибора удается наблюдать ряд микробов, которые другими методами не выявляются. Это вызвано тем, что условия развития микроорганизмов в педоскопе, вставленном в почву, близки к условиям развития микробов в самой почве: и в том и в другом случае развитие идет в капиллярах, микробы растут, прикрепляясь к их стенкам. Педоскоп (рис. 3) состоит из набора 5-ходовых капиллярных ячеек с тонкой кровлей, вставленных в стеклянную обойму. Каналы капилляров имеют ширину 0,65—- 1,0 мм и высоту 0,2—0,3 мм. В них и происходит развитие микробов.
Для работы используются педоскопы, простерилизованные сухим жаром. В рыхлую почву педоскопы вставляются без каких-либо дополнительных приспособлений под небольшим нажимом, в уплотненную почву — при помощи специального пробойника (рис. 4). Помещать педоскопы в почву следует так, чтобы каналы ячеек приняли вертикальное положение, т. е. положение по преобладающему направлению движения почвенного раствора.
После экспозиции в течение месяца или более длительного срока педоскопы извлекаются из почвы. Их поверхность тщательно протирается, и затем микроорганизмы, развившиеся в каналах капилляров, рассматриваются или в живом состоянии, или после фиксации и окрашивания.
Для просмотра содержимого капилляров в живом состоянии педоскопы, извлеченные из почвы, помещают на специальный столик (см. рис. 4), который предохраняет каналы капилляров от высыхания. Можно ходы каналов просто замазать парафином или пластилином.
Для рассмотрения фиксированных препаратов микроорганизмы в извлеченных из почвы педоскопах фиксируют в парах осмиевой кислоты, для чего педоскопические ячейки на 10 мин помещают в чашку Петри, содержащую несколько капель 2%-ной осмиевой кислоты. Препараты после фиксации выдерживают 30 мин на воздухе и затем окрашивают эритрозином. Канадским бальзамом ячейки укрепляют на специальной тонкой пластине (толщина 0,3—0,2 мм), заменяющей предметное стекло, и пластину вставляют в специальный держатель (рис. 4), который помещают на столик микроскопа. Во время микроскопирования необходимо ввести иммерсионное масло в каналы капилляров.
МОДИФИКАЦИЯ КАПИЛЛЯРНОГО МЕТОДА ПО АРИСТОВСКОЙ
Т. В. Аристовская (1965) рекомендует использовать метод Перфильева в следующей модификации. Стенки капилляров перед закладкой педоскопов в почву покрываются определенными фракциями гуминовых веществ. Это дает возможность приблизить условия развития микробов в педоскопах к почвенным условиям, при этом выявляются новые специфические для почвы микроорганизмы.
Гумусовые вещества с 0,1%-ным раствором агара выливают в стерильную чашку Петри и педоскопы боковой стороной погружают в них. Среда должна заполнить все капилляры. Затем педоскопы вынимают, обтирают их поверхность и помещают в стерильные чашки Петри, где среда подсыхает и равномерно покрывает стенки каналов капилляров. В каналах не должно образовываться перемычек. Часть среды можно оттянуть из каналов при помощи стерильной фильтровальной бумаги. Подсушенные капилляры вставляют в почву.