Статья: Теломерный белок Cdc13 дрожжей Hansenula polymorpha

Теломерный белок Cdc13 дрожжей Hansenula polymorpha

А.Н. Малявко

О.А. Донцова

Теломеры - особые структуры на концах хромосом - играют важнейшую роль в защите генетической информации. Строение теломер чрезвычайно разнообразно, даже у близкородственных видов теломеры зачастую заметно различаются. В данной работе в клетках термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha мы идентифицировали гомолог теломерного белка Cdc13. Показано, что этот белок способен специфично связывать одноцепочечную ДНК теломер, а также взаимодействовать с белком Stn1. Обнаружено взаимодействие между Cdc13 и белком TERT (основной компонент теломеразного комплекса), что указывает на возможное участие Cdc13 в привлечении теломеразы на теломеры H. polymorpha.

Теломеры - защитные структуры на концах эукариотических хромосом, состоящие из коротких повторяющихся G/C-богатых последовательностей ДНК и связанных с ними специальных теломерных белков. Особая организация концевых участков хромосом необходима для их защиты от узнавания системами репарации двухцепочечных разрывов. Теломеры - динамичные структуры: длина теломерной ДНК варьирует между хромосомами одной клетки и находится под влиянием множества факторов, регулирующих процессы укорочения (недоре - пликация, деградация) и удлинения (рекомбинация, теломераза) [1]. РНК-белковый комплекс теломераза содержит теломеразную РНК (TER) с коротким участком, служащим матрицей для синтеза теломерных повторов, обратную теломеразную транскриптазу (TERT) и ряд вспомогательных белков, модулирующих синтез теломерной ДНК.

Помимо двухцепочечной ДНК теломеры большинства организмов содержат короткий G-богатый одноцепочечный участок (выступающий З' - конец). В почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae этот участок ассоциирован с белком Cdc13 [2, 3], который играет ключевую роль в биогенезе теломер [4]. Так, мутация Cdc13-1 приводит к накоплению одноцепочечной теломерной ДНК и RAD9-зависимой остановке клеточного цикла в фазе G2/M [5]. Некоторые мутации в Cdc13 приводят к увеличению длины теломерной ДНК (например, V133E, K50Q, cdc13 - 5Д884-824) [6-8], в то время как мутации L91R, P235S, напротив, вызывают укорачивание теломер [6, 9], а штаммы с мутацией cdc13-2^E252K фенотипически не отличаются от штаммов с удаленными генами те - ломеразы [2]. Такие отличия связаны с нарушением белок-белковых взаимодействий, в которые вовлечены различные участки Cdc13. Этот белок состоит из четырех доменов, имеющих укладку типа OB-fold. Посредством домена OB3^DBD Cdc13 с высокой прочностью и специфичностью связывает теломерную оцДНК [10, 11]. N-Концевой домен OB1 необходим для димеризации белка, он участвует также в привлечении ДНК-полимеразы а к синтезу С-богатой цепи теломер [6, 7, 12, 13]. Домен OB2 содержит сигнал ядерной локализации, предположительно вносит вклад в димеризацию белка и связывание с другими белковыми партнерами [14, 15]. Между OB1 и OB2 располагается домен RD, положительно влияющий на синтез теломерной ДНК за счет привлечения те - ломеразы на теломеры и ее активации [16]. В состав RD входят два коротких участка, которые отвечают за взаимодействия с вспомогательным белком тело - меразы - Estl [17]. С-Концевой домен OB4, по всей видимости, вовлечен во взаимодействие с белком Stn1 [4, 8, 14, 18]. Белки Cdc13, Stn1 и Ten1 образуют комплекс CST, который считается теломер-специ - фическим аналогом комплекса RPA и играет важнейшую роль на теломерах многих эукариотических организмов [19].

В процессе эволюции теломерные последовательности почкующихся дрожжей сильно изменились, тем не менее, у большинства изученных видов З' - выступающие концы связаны гомологами Cdc13

[20] Однако у многих видов дрожжей рода Candida гомологи Cdc13 дуплицированы (Cdc13A и Cdc13B)

[21] Кроме того, каждый из гомологов обладает только двумя (из четырех) OB-fold-доменами, которые, по всей видимости, соответствуют OB3^DBD и OB4 [22, 23]. Несмотря на потерю OB1 и OB2, эти белки способны связывать теломерную ДНК и Stn1, они участвуют в регуляции длины теломер и проявляют склонность к димеризации [23, 24]. При этом у C. parapsilopsis связывать ДНК с высокой аффинностью способен только гетеродимер Cdc13A/Cdc13B [25].

В данной работе нами описан гомолог Cdc13 термотолерантных дрожжей Hansenula polymorpha - вида, эволюционно значительно удаленного как от S. cerevisiae, так и от видов рода Candida. Обнаружено, что по доменной организации HpCdc13 близок к Cdc13 C. albicans, но его ген представлен в геноме одной копией. HpCdc13 обладает свойствами, описанными для Cdc13 других дрожжей: он специфично связывается с оцДНК теломер, димеризуется, взаимодействует с Stn1. Более того, нами показано, что HpCdc13, несмотря на отсутствие RD-домена, способен взаимодействовать с теломеразой H. poly - morpha.

Экспрессия и выделение белка HpCdc13

Ген Cdc13 из штамма H. polymorpha DL-1 (ATCC 26012, или Ogataea parapolymorpha DL-1) клонировали в вектор pET30aTEV (любезно предоставленный Даниелой Родэс (Кембридж, MRC LMB, Великобритания)), который кодирует аффинные эпитопы 6His и S (добавляемые на N-конец белка), отрезаемые протеазой TEV. Полученной плазмидой трансформировали штамм Escherichia coli BL21

Star (DE3) pRARE. Синтез белка индуцировали 1 мМ изопропилтио^-О-галактозидом при 21°С в течение ~16 ч.

Клетки осаждали центрифугированием, ре - суспендировали в буфере для лизиса (50 мМ бис-Трис-пропан, pH 8.0, 500 мМ NaCl, 10 мМ Я-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0.05% Твин 20, 30 мМ имидазол, 1х коктейль ингибиторов протеаз и фосфатаз Halt (Thermo Fisher Scientific, США)) и разрушали ультразвуком (амплитуда 80%; 2 раза по 2 мин: 3 с каждые 10 с). Белок инкубировали в течение 30 мин с Ni-NTA-агарозой, промывали 4 раза буфером для лизиса, затем элюировали буфером для лизиса с добавлением 300 мМ имидазола.

Затем буфер заменяли на TEV-буфер (50 мМ бис - Трис-пропан, pH 8.0, 300 мМ NaCl, 1 мМ дитиотре- итол, 10% глицерин, 0.05% Твин 20, 0.3 мМ PMSF) при помощи гель-фильтрационных колонок PD Minitrap G-25 (Sigma, США). 6Нш^-эпитоп отрезали рекомбинантной TEV-протеазой (50 мкг на 1 мг Cdc13), инкубируя при +4°С в течение ~16 ч.

Отрезанный эпитоп и TEV-протеазу (тоже содержит 6Нш-эпитоп) удаляли при помощи дополнительной очистки на Ni-NTA-агарозе. В этих условиях HpCdc13 без эпитопа способен связываться с Ni-NTA, но легко смывается TEV-буфером с добавлением 50 мМ имидазола. Затем буфер заменяли буфером для хранения (50 мМ бис-Трис-пропан, pH 8.0, 300 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 5% глицерин, 0.3 мМ PMSF) при помощи PD Minitrap G-25 (Sigma) и хранили при +4°С. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически по поглощению при X = 280 нМ (коэффициент экстинкции рассчитывали при помощи ExPaSy ProtParam).

Электрофоретический анализ связывания Cdc13 c ДНК в полиакриламидном геле

Олигонуклеотиды метили по 5' - концу с помощью Т4 - полинуклеотидкиназы и [y-³²P] ATP (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколу производителя, затем очищали на колонках Illustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare). Связывание проводили в 20 мкл смеси, содержащей 0.1 нМ олигонуклеотид, 1-300 нМ Cdc13, 10 мМ бис-Трис-пропан, pH 8.0, 100 мМ NaCl, 0.5 мМ дитиотреитол, 5% глицерин, 0.5 мг/мл БСА. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин, добавляли 1 мкл буфера для нанесения (0.5 х Трис-боратный буфер, 50% глицерин, бромфеноло - вый синий, ксиленцианол) и наносили на 8% полиакриламидный гель (содержащий 1 х Трис-боратный буфер и 5% глицерин). Электрофорез проводили в течение 35 мин при 180 В при комнатной температуре. Радиоактивный сигнал детектировали с помощью системы Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare).

Дрожжевая двугибридная система

Векторы pGADT7 (для получения белка, слитого с доменом Gal4-AD) и pGBKT7 (для получения белка, слитого с доменом Gal4-BD) и штамм S. cerevisiae AH109 любезно предоставлены С.С. Соколовым (лаборатория фотохимии биомембран, МГУ им. М.В. Ломоносова). Анализируемые гены H. polymorpha DL-1 были клонированы в векторы pGADT7 и pGBKT7 по сайтам SmaI/NdeI и SmaI/NotI соответственно; за исключением CDC13, который клонировали в плазмиду pGADT7 по сайтам SmaI/EcoRI. В случае EST1 был клонирован участок, кодирующий аминокислотные остатки 1-591, поскольку попытка экспрессировать полноразмерный белок в штамме AH109 не привела к получению жизнеспособных колоний. Стоит отметить, что данный фрагмент EST1 высококонсервативен - известно, что соответствующий фрагмент из дрожжей Kluyveromyces lactis содержит все участки, необходимые для взаимодействия с Cdc13 [17]. Анализируемые пары плазмид ко - трансформировали в штамм AH109 по описанному протоколу [26], отбор клонов проводили на селективной среде SC-Leu-Trp. Единичные колонии ресуспен - дировали в стерильной воде и высевали на чашки с 2% агаром и необходимой селективной средой (SC - Leu-Trp или SC-Leu-Trp-His).

Поиск гомолога Cdc13 в H. polymorpha С целью обнаружения гомолога Cdc13 был проведен итеративный поиск PSI-BLAST по базе всех аннотированных белков почкующихся дрожжей с использованием в качестве поискового запроса последовательности белка Cdc13A C. albicans. В результате в H. polymorpha DL-1 обнаружили открытую рамку считывания HPODL_00415 (в базе данных Uniprot - W1QJ57) длиной 403 аминокислотных остатка, что значительно короче ScCdc13 (924 аминокислотных остатка), но примерно совпадает с длиной CaCdc13 (447 аминокислот). Уровень гомологии CaCdc13 и HPODL_00415 (далее HpCdc13) крайне низок: белки имеют лишь 15% идентичных и 31% схожих аминокислот, что распространено среди гомологов теломерных белков. Мы также провели поиск гомологов HPODL_00415 среди белков с известной структурой при помощи сервера HHpred, который использует при выравнивании не только последовательность, но и предсказанную вторичную структуру белков. Оказалось, что N-концевая часть HpCdc13 похожа на ДНК-связывающий домен OB3^DBD белка Cdc13 S. cerevisiae (PDB: 1KXL_A). Вторая копия гена CDC13 в геноме H. polymorpha DL-1 не обнаружена. Таким образом, мы заключаем, что в клетках

Рис. 1. Схема доменной организации гомологов Cdc13. Указаны номера первого и последнего аминокислотного остатка

теломера хромосома белок

H. polymorpha нами обнаружен вероятный гомолог белка Cdc13, доменная организация которого, скорее всего, сходна с организацией CaCdc13 (два OB-fold - домена, соответствующих OB3^DBD и OB4 ScCdc13) (рис. 1).

ДНК - связывающие свойства Cdc13 из H. polymorpha

Чтобы подтвердить, что обнаруженный нами гомолог Cdc13 может быть фактором, ассоциированным с З' - выступающим концом теломер H. polymor - pha, мы изучили способность этого белка связывать ДНК in vitro. Мы экспрессировали HpCdc13 в E. coli и выделили рекомбинантный белок при помощи аффинной хроматографии (рис. 2А). Полученный препарат белка инкубировали с различными ДНК - олигонуклеотидами и оценивали эффективность их связывания по изменению электрофоретической подвижности в нативном полиакриламидном геле. Как и следовало ожидать, HpCdc13 связывает олигонуклеотид G2, содержащий два теломерных повтора H. polymorpha (рис. 2Б, таблица). Наблюдали довольно прочное взаимодействие: больше половины G2 ДНК находится в комплексе при концентрации Cdc13 всего 1 нМ (рис. 2Б). В тех же условиях Cdc13 не связывает олигонуклеотиды С4 и GC4, содержащие четыре повтора С-цепи теломер и четыре повтора двухцепочечной теломерной ДНК соответственно, а также контрольный олигонуклеотид rnd с нетеломерной последовательностью. Следовательно, Cdc13 взаимодействует специфически с G-богатым З' - выступаю - щим концом теломер. Мы также протестировали два олигонуклеотида с G-богатой последовательностью, но отличной от теломерной ДНК H. polymorpha (олигонуклеотиды SACCE и CANAR, содержащие теломерные повторы S. cerevisiae и C. arabinofermentans соответственно, таблица). Оказалось, что Cdc13 способен связать эти олигонуклеотиды, однако получающиеся комплексы были нестабильными (в отличие от комплекса Cdc13-G2) и разрушались в процессе электрофореза. Таким образом, показано, что обнаруженный нами гомолог Cdc13 может распознавать З' - выступающий конец теломер H. polymorpha.

Рис. 2. ДНК-связывающие свойства рекомбинантного Cdc13 H. poly - morpha. А - анализ выделенного и очищенного рекомбинантного Cdc13 в денатурирующем полиакриламидном геле. М - маркер длины. Б - 0.1 нМ олигонуклеотид инкубировали с Cdc13 в возрастающей концентрации (1,3, 10, 30, 100, 300 нМ) и анализировали с помощью электрофореза в нативном полиакриламидном геле.

Названия олигонуклеотидов указаны под каждой из электрофореграмм, их последовательности приведены в таблице

ДНК-олигонуклеотиды, использованные в работе

HpCdc13 как компонент комплекса CST

Другой важной отличительной чертой дрожжевых белков Cdc13 является тот факт, что они входят в состав комплекса CST. В составе комплекса Cdc13 контактирует непосредственно с белком Stn1, который, в свою очередь, связан с Ten1 [19]. Существование таких взаимодействий у гомологов H. polymorpha мы проверили при помощи дрожжевой двугибридной системы на основе штамма AH109 S. cerevisiae, используя ген HIS3 в качестве репортерного. В данной системе связывание белков можно детектировать по способности штамма расти на среде без гистидина. Действительно, мы наблюдали взаимодействие между парами белков Cdc13-Stn1 и Stn1-Ten1 H. polymor - pha, но не Cdc13-Ten1 (рис. 3А), как описано у других видов дрожжей. Кроме того, по данным, полученным в двугибридной системе, Cdc13 (а также Stn1) H. polymorpha проявляет способность димеризоваться (рис. 3А), что также известно на примере других видов дрожжей [4]. Таким образом, Cdc13 H. polymorpha может входить в состав комплекса CST.

Возможная функция Cdc13 на теломерах H. polymorpha

Важная черта гомологов Cdc13 из C. albicans и H. polymorpha, отличающая их от Cdc13 из S. cerevisiae, - небольшой размер, а именно, отсутствие двух N-концевых OB-доменов и участка RD между ними (рис. 1). В клетках S. cerevisiae этот участок отвечает за взаимодействие Cdc13 с компонентом теломеразного комплекса Est1, что необходимо для посадки теломеразы на З' - конец теломер и синтеза теломерной ДНК [17]. Означает ли отсутствие RD-домена в укороченных гомологах Cdc13 потерю этой важной функции? Мы протестировали HpCdc13 и HpEstl при помощи двугибридной системы и не обнаружили взаимодействия между этими белками (рис. 3Б), что согласуется с отсутствием RD-домена в Cdc13 H. polymorpha. Однако мы наблюдали взаимодействие между HpCdc13 и HpTERT - основным компонентом теломеразного комплекса. Этот результат указывает на то, что Cdc13 H. polymorpha все-таки может выполнять функцию привлечения